我国食用菌遗传多样性的研究方法概述

春雨菌业

作者：刘桂娟  姚方杰  陈影  方明　(1．吉林农业大学园艺学院  长春  130118；2．食药用菌教育部工程研究中心  长春  130118)

林业实用技术　2011（2）

　　遗传多样性作为生物多样性的重要组成部分，是生态系统多样性和物种多样性的基础。我国是菌物种类最丰富的国家之一，已知菌物约1万种，大型真菌估计3 800种以上，食药用菌达近2 000种，其中已知食用菌达981种。大多数食用菌的子实体形态分化和差异较小，遗传表达受外界环境影响易出现不稳定。食用菌这一生物学特点，使得食用菌遗传多样性的研究具有重要意义。
　　随着人们对食用菌资源可持续发展认识的深入，有效利用和保护食用菌资源的意识越来越强。因此，近年来食用菌遗传多样性的研究受到高度重视，在此方面也取得了许多成果。本文从食用菌形态学、细胞学、生化和分子方面介绍了其遗传多样性的研究方法及其进展。
　　1　形态学研究方法
    一般而言，在微生物中，用来区分不同个体的形态特征，包括显微特征及菌落特征两部分。食用菌的形态主要包括菌丝体形态和子实体形态两部分。
　　由于形态观察简单直观，容易观察记载，长期以来都是物种分类及鉴定的重要指标。如栽培种类最多的侧耳属一直是以形态特征为依据，即子实体大小、菌盖直径、形状、颜色；菌肉颜色、气味；菌褶形态、颜色与菌柄的关系；菌柄长度、粗细、着生方式等。我国野生大型真菌资源的调查、考察和分类鉴定，也是以子实体外部形态为依据进行的。
　　2　细胞学研究方法
　　细胞学研究方法是指能明确显示遗传多态性的细胞学特征，如染色体的形态、数目和结构在不同物种中的差异。体细胞营养不亲和性系统是一种识别异己的遗传系统，在多数真菌中，该系统能引起遗传上明显不同的个体在交接区产生特征性的拮抗反应，广义上把拮抗作用也归在细胞学范围内。
　　应用脉冲场凝胶电泳、脉冲场梯度凝胶电泳、垂直交变电场电泳、等高锁状均质电场电泳、反转电场凝胶电泳等各种场凝胶电泳这些技术，已得到了多个属的真菌染色体的数目、大小和基因组大小。边银丙等利用等高锁状均质电场电泳技术对黑木耳(A auricula)核型进行分析，估计黑木耳基因组中至少包含9条DNA分子量在850～5 800 kb的染色体，多数染色体DNA分子量在1 000～3 400 kb，基因组大小在22 Mb以上。陈春涛等对33个香菇菌株进行了拮抗性测定，结果显示有些菌株与其余菌株间形成很明显的拮抗线，而有些菌株间拮抗反应却很弱。
　　3　生化研究方法
　　生化研究方法有很多，食用菌中较常用的是酯酶同工酶方法。罗升辉运用酯酶同工酶电泳技术对组合的亚侧耳菌株进行选育，选出遗传特性不同的杂交菌株。王波等对19个白色金针菇菌株和14个黄色金针菇菌株以及黄色金针菇F411菌株的6个组织分离菌株进行了酯酶同工酶分析。结果表明，白色金针菇与黄色金针菇在谱带上存在差异，且一些酶谱带可作为区别黄色金针菇与白色金针菇的特征酶谱带。韩增华等利用酯酶同工酶技术可以区分单核菌株和杂交新菌株的不同核型。
　　4　分子研究方法
　　随着分子生物学的发展，DNA分子技术日益受到关注。分子研究方法大致分为3类：第1类是基于DNA分子杂交的方法如RFLP等；第2类是基于PCR技术的DNA扩增方法，它又可分为2类，一是使用随机引物进行扩增主要指RAPD，另一类是采用特定引物或引物对扩增的标记如SCAR等；第3大类是PCR与酶切相结合的方法如AFLP等。
　　4．1　RFLP研究方法
　　RFLP是最早出现、发展较完善的分子技术。李英波等对32个香菇菌株，用限制性片段长度多态性探针，可检测到丰富多态性，认为RFLP具有研究香菇种内遗传分离的潜力。
　　随着PCR技术的发展而产生的PCR—RFLP技术简化了RFLP技术的操作，对一些分子量较小、易纯化的DNA样品如线粒体DNA等PCR的扩增产物，可以酶切后直接进行电泳分析，不需杂交即可表现出丰富的多样性。方明采用MS引物和ITS引物对线粒体核糖体小亚基rDNA、核基因组rDNA内转录间隔区进行PCR扩增，测定MS序列和ITS序列。通过相关软件进行序列分析并构建了系统关系图。刘秀明采用线粒体DNA(mtDNA)一Ms序列对松茸进行系统研究，结果表明：不同分布区域、不同宿主的松茸菌株遗传背景不同；美洲的松茸有明显的宿主差异；亚洲的松茸和欧洲的松茸MS序列具有高度同源性；北非的松茸与亚洲、美洲和欧洲的松茸有明显的遗传差异。
　　4．2 　RAPD和SCAR研究方法
　　RAPD是1990年由Williams等发展起来的一种在全基因组DNA水平上的一种多态性检测技术。邓旺秋等利用RAPD技术对山东省8个草菇主要栽培菌株的亲缘关系和遗传多样性进行研究，获得了草菇不同菌株的DNA指纹图谱。宿红艳等采用RAPD技术对10个不同的白灵菇菌株进行遗传多样性分析。谭琦等利用RAPD技术，对香菇非对称杂交的亲本与后代之间的遗传相关性进行了分析。结果表明，非对称杂交后代与单核受体遗传距离(85％)较近，而与双核供体遗传距离(61％)较远。
　　Paran和Micelmorel993年提出了SCAR。将RAPD片断从凝胶上回收并克隆测序，根据序列再设计特异引物(18—24碱基)，其扩增结果稳定性好，可重复性强。吴学谦等[163由RAPD开发出SCAR技术对香菇菌株进行快速鉴定，获得的香菇菌株162和中香10号的特异SCAR标记，能准确鉴定香菇菌株162或中香10号的真伪。宋春艳等E1 73在RAPD扩增的基础上，获得了香菇135菌株的SCAR标记，在163个香菇菌株上进行了SCAR扩增，鉴定出9个菌株都含有SCAR标记，用拮抗反应和AFLP验证分析和调查，表明9个菌株都是香菇135菌株的同物异名。
　　4．3 　AFLP研究方法
　　结合RFLP技术的可靠性和RAPD技术的高效性，Zabeau和Vos发明了AFLP的DNA技术，Vos将它推广应用。卓英等采用AFLP技术分析了31个主要香菇栽培菌株的DNA多态性，表明菌株之间存在一定的遗传差异，可分成4个类群，认为AFLF技术是香菇菌种快速鉴定的有效技术手段。许晓艳等利用AFLP和SRAP标记，对19株毛木耳进行遗传多样性分析。结果表明，AFLP和SRAP标记均适合毛木耳遗传多样性分析。
　　5  展望
　　综上所述，食用菌遗传多样性可以体现在从形态到DNA的各个水平上。形态学和细胞学可在短期内对遗传变异大小有一个大致的了解；生化方法在技术上较为成熟，能从分子水平上对遗传变异进行比较客观的度量，而且实验条件简便、快速，是目前仍在使用的主要方法之一；由于分子方法是以遗传物质DNA本身的差异为基础的，所以从理论上说，它在任何形式的遗传研究中，均可以应用。不过在那些使用其它遗传标记难以奏效的领域，尤其是研究某一个由许多个体组成的群体的遗传差异时，采用分子研究方法效果尤为明显。
　　上述的各种方法并不互相排斥，可以同时采用几种方法进行研究，互相补充，以便多层次、多角度、更全面地揭示食用菌遗传多样性水平。