组培生产常见问题及培养基配置

春雨菌业

玻璃化及防治






组培苗的玻璃化

在进行植物组织培养时，经常会发现试管苗生长异常，表现为试管苗叶、嫩梢呈水晶透明或半透时，水浸状；整株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲、脆弱易碎；叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织。这种试管苗生长异常现象就是 “玻璃化”（Vitrification），是植物组织培养过程中所特有的一种生理失调或生理病变。玻璃苗中因其体内含水量高，干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和森质素含量低、角质层、栅栏组织等发育不全，表现为光合能力和酶活性降低，组织畸形，器官功能不全，分化能力降低，所以很难继续用作继代培养和扩大繁殖的材料；生根困难，移栽后也很难成活。






植物微体快速繁殖时玻璃苗的出现已成为一种很普遍的现象，该苗有时多达50%以上，严重影响繁殖率的提高，已成为茎尖脱毒、工厂化育苗和材料保存等方面的严重障碍，造成人、财、物的极大浪费，所以试管苗下班化现象对植物组织培养的危害是相当严重的，也是亟待解决的问题。



导致玻璃化的主要因素：

1．材料差异，在不同的种类、品种间，组培苗的玻璃化程度有所差异。

2．激素水平过高，若细胞分裂素浓度过高或细胞分裂素与生长素相对含量高，易引起玻璃化现象。

3．培养基水势，培养基中离子种类，比例不适。

4．环境温度、光照强度和通气性。温度过低或过高，光照时间强度不足及培养容器中空气湿度过高，透气性较差所造成的通气不良，易造成组培苗含水量高，从而发生玻璃化现象。

5．琼脂浓度降低、有杂质等。






常用的防治措施有：

1．增加光照强度和光照时数。

2．降低细胞分裂素含量。在培养基中添加少量聚乙烯醇、脱落酸等物质，能够在一定程度上减轻玻璃化的现象发生。

3．增大培养基中琼脂的含量，以降低培养基的水势。

4．降低NH4+浓度，减少培养基中含氮化合物的用量。

5．增加容器通风，最好进行 CO2施肥，这对减轻组培苗玻璃化的现象有明显的作用；降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻组培苗玻璃化的现象发生。



组培苗的黄化及防治



组培苗的黄化

黄化是指在组培过程中由于培养基成分、环境、激素、碳水化合物等各种因素引起的幼苗整株失绿，全部或部分叶片黄化、斑驳。这一现象在植物组织培养中比较常见，特别在部分木本植物、花卉中较为常见。






影响组培苗黄化的因素

1、培养基中Fe的含量不足, 各矿质营养不均衡；

2、培养环境通气不良，瓶内乙烯含量升高；

3、激素配比不当；

4、PH值变化过大；

5、糖用量不足或长时间不转移糖已耗尽；

6、培养温度不适；光照不足等。






防治组培苗黄化的方法

1、首先在配制母液和培养基的制作过程中，要检查仪器设备是否准确，还要认真细致地核对每项称量的每一个环节；

2、使用透气的封口膜以改善瓶内通气状况；

3、适当调节pH值、激素配比和无机盐浓度；

4、配制培养基时切记不要忘记加糖,及时转接培养物；

5、控制培养室内的温度,适当增加光照；

6、在培养基中添加抗生素类物质如青霉素、链霉素、头孢霉素等，有时也会出现幼苗黄化现象，应适当减少用量或停止使用。









组培苗的褐变及防治



组培苗的褐变

很多种类的植物体中含有大量多酚类化合物，切取芽时的创伤会激活组织中的多酚氧化酶，将多酚类物质氧化为棕褐色的醌类物质，使外植体的切口处发生褐变，产生可见的茶色、褐色或黑色，此即谓“酚污染”。醌类物质会渗透到培养基中，使培养基褐化，其结果是严重影响培养物的生长和分化，甚至造成培养物死亡。在木本植物，尤其是热带木本植物及少量草本植物中，此现象较为严重。






影响褐变的因素

植物的种类褐基因型、外植体的来源和生理状况以及培养基的成分都会不同程度的影响褐变的程度。一般木本植物的外植体比较容易产生褐变现象，在成年树尤其严重。培养基中含酚过高会导致褐变，含过高浓度的无机盐和肌醇也会加剧外植体的褐变。6-苄氨基嘌呤（6-BA）和激动素（KT）也有诱导褐变的作用。强光和高温同样会促进褐变现象。






防治褐变的方法

1、在培养基中加入抗氧化剂是防止褐变的有效措施。

常用的抗氧化剂有抗坏血酸（VC）、柠檬酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等，该类药剂一般需用浓度为50-200mg/L。

具体方法如下：

（1）用经过滤灭菌的抗氧化剂溶液洗涤刚切割的外植体伤口表面；

（2）将抗氧化剂加入固体培养基的表层；

（3）将刚切割的外植体浸入其中一定时间，

（4）或者在抗氧化剂溶液中切割和剥离外植体。

（5）必要时还可以将几种抗氧化剂结合使用。






2、在培养基中加入活性炭，吸附对生长有抑制作用的褐色醌类物质。

一般认为，活性碳主要吸附非极性物质及色素大分子，可以减少一些有害物质的影响，但是具体吸附的选择性很差，温度低时吸附力增强，温度高时吸附力减弱，甚至会解吸附。通常活性炭的使用浓度为0.5-10g/L。大量活性炭的加入会削弱琼脂的凝固能力，因此要多加些琼脂；很细的活性炭容易沉淀，因此通常在琼脂将要凝固时，需轻轻摇动培养瓶；应当注意的是：活性炭也能吸附培养基中的激素类物质，影响茎尖的分化和生长，因此在使用活性炭的场合，需要适当提高培养基中激素的浓度。






3、不断地（每隔1～2d）将培养物转移到新鲜的培养基上，以摆脱老培养基中褐色物质的不利影响。在使用液体培养基的情况下，这种方法相当有效。



4、为了防止外植体的褐变，需要选取酚类化合物含量较低的实验材料，选择无机盐含量较低，不加肌醇的培养基，并在较弱的光线或黑暗的条件中进行培养。






5、易发生褐变的植物在进行组织培养时，先进行预培养（即培养在基础培养基中）2-3天（如果分泌物多，如利用花魔芋的球茎进行组织培养时，适当延长预培养时间并多次更换培养基），再培养到添加了激素的培养基上。



组培常遇见的问题



两次培养基用的配方都一样，为什么一个凝固的特好，一个就凝固不了？

培养基的凝固与否无外乎有下列几种情况：

1、琼脂批次有变，没有做批次试验，沿用以前的用量造成不足。

2、大量元素重复加入，或大量元素母液配制时出错。

3、pH值调的过低，或有活性炭高压灭菌时间过长，造成蔗糖分解量剧增，影响培养基的pH值降低较多。

4、加入新的天然附加物，或附加物过多。



75%的酒精和70%的酒精有什么区别，组培时用哪种好?

酒精的70%和75%都是可以的，但往往由于桶装酒精的浓度达不到95%，这样按照70%的配制就达不到要求了，因此我们一般是桶装按照75%的配，瓶装则按照70%的配。



大型灭菌器在灭菌的时候总会出现个别瓶子破裂的现象，请问什么原因？是温度过高，压力过大，还是内部冷热不均造成的呢？

高压灭菌造成玻璃瓶的破裂，特别是大型灭菌装置，最主要还是在放气冷却时造成的。究其原因，应该是在放气时，由于容积较大，压力在不同位置（内外部）的变化速度并不相同，致使瓶内与瓶外的压力差距较大，如果是封口膜，表现的可能就是塑料膜的破裂。



初代培养时，外植体出现发白，慢慢枯死，是什么原因？

外植体的初代培养出现这种情况，是比较好理解的。大田植物材料离体以后，进入不同环境中继续生存代谢，需要一个过渡。

首先，植物材料要吸收培养基的养分，不再是根吸收，盐类浓度相对于离体的植物材料的吸收能力可能是过量的，植物材料褪色就是叶绿素形成受阻和细胞代谢受阻，另外培养基养分供应的有效性滞后，以及植物材料本身内含物向培养基的流失等等。建议在初代培养阶段最好先采用空白培养。






做无毒苗的快繁，一直找不到合适的培养基，能不能帮我推荐一种？

关于组培快繁的方式概括起来有下列两种途径：

1、外植体－愈伤组织－再生芽－继代－生根－出苗

2、外植体－丛生芽－继代－生根－出苗

至于采取那种途径，需要彻底了解所选组培植物的生物习性，包括繁殖方式，顶端优势，萌孽生根能力等。



一般情况下KT的母液应该配成多大浓度？IAA能高压灭菌吗？高压灭菌成分会变吗？

KT一般配成0.05－0.1ppm。IAA极不耐高压灭菌，一般采用过滤灭菌。如果利用高压灭菌其分解率会在85%以上，致使其作用不明显。



请问植物病毒检测的简便方法？

由于经过脱毒处理，即使未完成脱除病毒的植株，其体内病毒的含量也会较低，常常在最初的一、二次病毒检测中呈阴性，因此有人建议在前18个月内，必须对植株进行若干次检测。目前常用的植物病毒检测方法有可见症状鉴定、寄生鉴别、抗血清检测、电镜检测、分子检测等。



可见症状鉴定法较简单，但准确性差，对于不表现可见症状的隐症病毒几乎无效；而电镜检测、分子检测虽然检测准确率高，但设备昂贵，尤其电镜不可能每个组培室都配备，故未在生产上广泛运用；目前生产上，国内外仍主要采用鉴别寄主的酶联免疫检测法检测植物病毒。






组培苗生长环境有何特点？如何针对这些特点提高移栽成活率？

组培苗炼苗是组培过程中较为重要的一个环节，是一个较为复杂的技术体系，提高炼苗成活率是决定组培成败和降低组培成本的关键。



试管苗一般在高湿（100%）、弱光（3000-4000Lux）、恒温（25℃）下培养，生长的植株有以下几个特点：（1）、叶片无保护组织（角质层、蜡质、表皮毛等），加之细胞间隙大，气孔开张大，因此水分散失较快，易于萎蔫。(2)、根无根毛或极少，并且有些从愈伤组织上发育的根与芽的疏导组织不相同，因此吸水能力较弱。而当炼苗移栽时，环境有了极大的改变：湿度降低、光照增强、温度升高、温差变大。



具有以上特点的组培苗，在此环境下，叶片失水较严重，根系吸水能力不足，即吸水量小于蒸腾水量，从而造成植物萎蔫，炼苗失败。另一种情况是，空气温度上升要比基质温度上升快，而根系的吸水能力在一定范围内与温度是成正比的，当气温升高时，加之湿度较低，叶片蒸腾急速增加

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