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韩增华 张丕奇 戴肖东 孔祥辉 马庆芳 张介驰 食用菌学报 黑木耳(Auricularia auricula)是我国广泛人工栽培的食用菌品种,随着黑木耳栽培产业的不断扩大,促进产业良性发展的优良菌种成为关键。目前所用菌种主要来源于野生菌种分离和自然诱变育种,而关于原生质体诱变育种、杂交育种等研究较少[1,2]。
早在1972年DE VRIES和WESSELS用裂解酶分离得到了裂褶菌原生质体[3]。八十年代以后,食(药)用菌原生质体技术得到广泛发展[4~6]。目前食用菌原生质体技术已成为食(药)用菌生理、生化、遗传等基础理论研究和进行菌种改良的一种有效手段[7]。原生质体融合技术研究和单核杂交技术研究,都是以原生质体的成功制备与再生为前提条件[8~10]。本文探讨了黑木耳原生质体制备、再生的条件并对制备的单核菌株进行荧光染色鉴定,为黑木耳菌种选育提供参考。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株
黑木耳菌株黑29、8808、981、HW2、HW5和139由黑龙江省科学院微生物研究所提供。
1.1.2培养基
OSF培养基:洋葱200 g(煮汁),蔗糖10 g,阿魏酸0.06 g,加水至1000 mL,用于制备原生质体前的黑木耳菌丝体培养。
液体再生培养基:土豆200 g(煮汁),甘露醇109.3 g,葡萄糖20 g,蛋白胨2.0 g,KH2PO4 3.0 g,酵母膏2.0 g,MgSO4 1.5 g,维生素B1 10.0 mg,加水至1000 mL,用于原生质体孵育。
CYM培养基:土豆200 g(煮汁),葡萄糖 20 g,维生素B1 10.0 mg, KH2PO4 3.0 g,蛋白胨2.0 g,酵母膏2.0 g,MgSO4 1.5 g,琼脂20 g,加水至1000 mL,用于制备高渗再生培养基。
高渗再生培养基:CYM培养基中分别添加蔗糖、甘露醇、MgSO4和KCl,浓度为0.5 mol/L,用于原生质体再生菌落筛选。
cPDA培养基:土豆200 g,葡萄糖20.0 g,硫酸镁1.5 g,KH2PO4 3.0g;蛋白胨0.5 g,维生素B1 10.0 mg,琼脂粉14.0 g,水1000 mL,用于母种、单核菌株培养。
1.1.3试剂
0.6 mol/L MgSO4高渗液;0.5 mol/L 的KCl、MgSO4、蔗糖、甘露醇稳渗剂:用0.05 mol/L pH 5.8的磷酸盐缓冲液配制;0.5%、1.0%、1.5%的溶壁酶:用0.05 mol/L pH 5.8的磷酸盐缓冲液配制0.6 mol/L MgSO4,然后用MgSO4溶液配置溶壁酶溶液;荧光核染料Hoechst33258:用0.1 mol/L柠檬酸缓冲液,pH 7.2配制荧光核染料[11]。
1.2方法
1.2.1菌丝培养
试管斜面中加入5 mL OSF培养基,用接种针挑取菌种表面菌丝,将此培养液接种于装有80 mL OSF培养基的三角瓶中(250 mL),25 ℃静置培养,备用。
1.2.2原生质体制备条件筛选
选用菌株29为材料,借用正交试验表L9(34)进行原生质体制备条件的优化实验,试验因素和水平见表1。
无菌条件下用120目孔径的尼龙网过滤收集黑29菌株培养获得的菌丝体,无菌水冲洗1次,用0.6 mol/L MgSO4高渗液冲洗后,2000 ×g,离心10 min,收集的菌丝用0.6 mol/L MgSO4高渗液再冲洗1次,2000 ×g,离心10 min,用无菌滤纸吸干水分,按菌丝体∶酶液=1∶2(m∶V)的比例添加酶液,震荡2 min,混匀,在不同温度下振荡酶解不同时间,无菌条件下用300目尼龙网过滤,无菌管收集滤液,用0.6 mol/L MgSO4高渗液冲洗2次,3000 ×g离心5 min,沉淀用0.5 mol/L MgSO4稳渗剂洗涤离心(3000 ×g,5 min)2次,用0.5 mol/L MgSO4稳渗剂稀释至一定体积后,血球计数板计算原生质体数量。
1.2.3正交试验后的原生质体再生
将制备的原生质体溶液稀释至2×104个/mL后加入等体积的液体再生培养基,25 ℃静置孵育2 h,取孵育好的原生质体0.1 mL涂皿,采用0.5 mol/L的蔗糖高渗再生培养基,使每皿原生质体数目达到103个,25 ℃下静置培养20 d,观察平皿中的再生菌落数。
原生质体再生率计算:再生率=再生菌落数/原生质体总数×100%。
1.2.4稳渗剂对原生质体再生率的影响
收集菌株8808、黑29、981、HW2、HW5和139培养获得的菌丝,分别以0.5 mol/L的蔗糖、甘露醇、硫酸镁、氯化钾为渗透压稳定剂,其它因素参考正交试验筛选出的最佳条件,按1.2.2中的操作制备原生质体。采用相应的高渗再生培养基,原生质体再生按1.2.3中的操作进行,计算再生率,确定最佳稳渗剂种类。用筛选出的稳渗剂配置0.3 mol/L、0.5 mol/L、0.7 mol/L系列浓度,按上述方法进行原生质体制备和再生,计算再生率。
1.2.5原生质体再生菌株培养
挑取涂布于蔗糖高渗培养基中萌发的菌落,于cPDA斜面上25 ℃培养15 d,将所获得的菌株编号,4 ℃保藏备用。
1.2.6单核与双核菌株荧光显微镜核相检测
将各双核菌株和再生的原生质体菌株分别接种于直径为88 mm的cPDA平皿中,距接种点约15 mm 处插一无菌盖玻片,25 ℃静置培养,待菌丝爬至2/5插片时,取已爬壁的菌丝插片,菌丝面向下,扣于已滴染色液的载玻片上, Hoechst33258染料染色3 min,于荧光显微镜下观察菌丝核相,确定单、双核菌株[11]。
2 结果与分析
2.1原生质体制备、再生正交试验结果
由表2可见,原生质体制备最佳条件组合是A2B3C1D2,即酶解温度31 ℃、酶浓度1.0%、菌龄5 d、酶解时间4 h。从R值可知,酶解温度对原生质体产量影响最大,其次依次为酶浓度、菌龄和酶解时间。
表3为原生质体再生率正交分析结果。表3表明,原生质体再生率最佳条件组合是A3B3C3D1,即酶解温度27 ℃、酶解时间4 h、酶浓度1.5%、菌龄11 d。对黑木耳原生质体再生率影响最大的因素是酶解温度,其次为酶解时间和酶浓度,影响最小的因素是菌龄。
2.2稳渗剂对原生质体再生率的影响
表4为0.5 mol/L的蔗糖、甘露醇、硫酸镁和氯化钾为渗透压稳定剂时原生质体再生的结果。表4表明,稳渗剂对黑木耳原生质体再生有很大影响,蔗糖对黑木耳原生质体再生效果最佳,再生率最高可达2.4%,其次为甘露醇和硫酸镁。氯化钾为稳渗剂时,原生质体再生效果最差,培养过程中无菌落萌发。相同条件下来源于不同菌株的原生质体其再生率也不同,以蔗糖为稳渗剂时,139菌株原生质体再生率最低,而HW2、HW5菌株的再生率较高。
表5是以0.3 mol/L、0.5 mol/L、0.7 mol/L蔗糖为稳渗剂时,不同菌株原生质体的再生率。当蔗糖浓度为0.5 mol/L时,各菌株的原生质体再生率最高,在此浓度下HW5和HW2的再生率分别达2.4%和2.1%。
2.3不同菌株原生质体单核化比率
表6为不同菌株原生质体单核化比率。表6表明,单核比率最高的是HW2菌株,为35%;981菌株单核比率最低,仅为14%。
2.4单、双核菌株的荧光显微镜核相
图1可见,荧光显微镜下各菌株单、双核清晰可辨,供试的6个菌株制备的单核,其菌丝分枝较双核菌株少,核距远,菌丝交叉较少,在cPDA培养基上生长较细弱。
3 讨 论
正交试验结果表明,对原生质体制备及再生影响最大的因素是酶解温度,菌龄对原生质体制备影响较大,但对再生率影响较小;酶解时间对原生质体制备率影响不大,但对再生率有一定的影响;黑木耳原生质体制备的最佳条件是酶解温度31 ℃、酶浓度1.0%、菌龄5 d、酶解时间4 h;原生质体再生的最佳条件为酶解温度27 ℃、酶解时间4 h、酶浓度1.5%、菌龄11 d。
稳渗剂对原生质体维持正常的渗透压至关重要,其种类和浓度对原生质体的分离有着较大影响[12]。据报道,无机盐、糖类及糖醇都是适宜的渗透压稳定剂[4],不同稳渗剂对原生质体制备、再生有很大的影响[13,14]。本研究表明,以0.5 mol/L蔗糖为稳渗剂时有利于黑木耳各菌株原生质体的制备和再生。
荧光核相观察是一种较直接的鉴别单、双核菌丝的方法,是目前快速区分单、双核菌丝的有效方法,荧光显微镜下单、双核菌株清晰可辨,但要鉴别两个核是同源或异源,还必须结合其它分析方法。本实验通过核相观察,确立了单核和双核菌株,为进一步核相鉴定提供了试验材料。研究还发现单核菌株在cPDA培养基下培养易形成分生孢子,具体的形成规律和机理尚有待进一步研究。
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朱丽娜
Preparation, Regeneration and Identification of
Monokaryotic Protoplasts of Auricularia auricula
HAN Zenghua,ZHANG Piqi*,DAI Xiaodong,KONG Xianghui,
MA Qingfang,ZHANG Jiechi
Institute of Microbiology, Heilongjiang Academy of Sciences, Harbin, Heilongjiang 150010, China
Conditions for the preparation and regeneration of Auricularia auricula protoplasts were optimized using orthogonal testing. Highest protoplast yields were obtained from 5-day-old mycelium after treatment with 1.0% (w/v) lywallzyme for 4 h at 31 ℃, while the highest protoplast regeneration rate was obtained from 11-day-old mycelium after treatment with 1.5% (w/v) lywallzyme for 4 h at 27 ℃. Of four osmotic stabilizers tested (sucrose, mannitol, MgSO4 and KCl), the highest rate of protoplast regeneration was obtained using 0.5 mol/L sucrose. Monokaryotic and dikaryotic mycelia were readily distinguishable using fluorescence microscopy. The highest rate of monokaryotic protoplast formation was recorded with A. auricula, strain HW2.
Auricularia auricula;protoplast;regeneration;monokaryotic protoplast;fluorescence staining of nuclei
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发表于 2012-3-26 15:32:04
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