黑木耳菌种厂建造及黑木耳菌种生产技术规程

春雨菌业

1　范围
本标准规定了黑木耳菌种厂建造及黑木耳菌种生产技术规程。
本标准适用于黑龙江省黑木耳菌种厂建造及黑木耳菌种生产的单位与个人。
2　名词解释
2.1　母种：用各种分离方法，经纯化培养成的纯黑木耳试管菌种（一级种）。
2.2　原种：用母种扩接在木屑、谷粒等培养基上，经培养成的菌丝体，称原种（二级种）。
2.3　栽培种：用原种扩大增殖的菌种，称栽培种（三级种）。
2.4　无菌操作技术：又叫不带菌作业。指操作的空间、使用的水质、原料、工具以及人员操作过程中，不准带有任何杂菌。
2.5　培养基：培养黑木耳菌种生长所需要的营养物质。
2.6　菌种分离：指食用菌母种（一级种）的分离、纯化培养。从基物、子实体、菌丝体培养物中取得纯菌种的过程。
2.7　孢子分离法：挑取孢子（种子），获得纯培养物的方法。
2.8　耳片分离法：从耳片中挑取菌丝体组织，获得纯培养物的方法。
2.9　耳木分离法：又叫寄主分离法，从黑木耳生存的基物（木段）中，获得纯培养物的方法。
3　黑木耳菌种厂建造
3.1　厂地选择：设在远离污染源300m以上，空气新鲜，交通方便之处。
3.2　厂内条件：有水源、电源、供热设备。
3.3　厂房结构：砖木、砖混结构，水泥地面，四壁、天棚白色、光洁。
3.4　厂房布局：按生产工艺流程，分设配料室、灭菌室、冷却室、缓冲室、接种室、培养室、储存室、试验室。各室既相连接又相隔


3.5　所需技术设备： 以上各室技术要求及所需仪器、设备、用具见表1。
表1　技术要求及仪器、设备表
名称
用途
技术要求
所需仪器、设
备、用具
备注
配料室
原种、栽培种培养基调配、分装
上下水道、水泥地面、拌料均匀、卫生
计量工具、拌料装料工具（装瓶装袋机）、拌料池（盘）、菌种瓶、塑料袋等
作原种、栽培种配料装料
灭菌室
培养基灭菌
水源、电源、供蒸气设备，通风、卫生
高压蒸气灭菌锅或灭菌效果好的土蒸锅、换气风扇
土蒸锅用砖、水泥砌成
冷却室
培养基灭菌后
冷却
地面卫生、室内通风、冷却28℃以下
安换气风扇、摆放
筐、架
冷却后直入缓冲室供接种
缓冲室
接种前的隔离
室、接种人员更衣、消毒
更换白色工作服、帽、穿拖鞋、洗手消毒
洗手盆、更衣柜、紫外线灯照明灯、喷雾器、消毒药品柜、拖鞋、毛巾、肥皂、安拉门
准备好后，入室接种
接种室
无菌室（不带菌作业室）
无尘、无杂菌、密闭、肃静
6m2～8m2
紫外线灯、照明灯、超净工作台、接种箱、接种工具、酒精灯、棉花、喷雾器、刀剪消毒药品、废物筒
接种人员一气接完菌种，不准中途离岗再入
培养室
培养菌种成熟
能升、降温、20℃～28℃、通风、洁净、消毒
培养架光滑、消毒、测温计、通风、遮光设备
架子2.5m～3m高，便于操作
储存室
储存菌种不变质
卫生、干燥、遮光、通风、温度1℃～5℃、防鼠害
储存架、换气风扇、遮光降温设备、地面撒石灰粉
专用
试验室
母种配料、装料、分离培养、选育良种、分析检测
绝对卫生、有水源、电源、
药品柜、仪器柜、恒温箱、电冰箱、显微镜、天平、超净工作台、酒精灯、卫生棉喷雾器、玻璃器皿、瓷盘、空调设备等
科研之用
4　母种
4.1　 母种的分离
4.1.1　孢子分离法：选当年生无杂菌污染耳片晾干，以黑、厚、大为佳；经无菌水冲洗几次，用丝线将耳片腹面向下，另一端挂吊在装有培养基的三角瓶口部，加棉栓封口，在25℃～28℃温箱中，接收孢子并培养成菌丝；经镜检有锁状联合后，再经纯化转管培养即可。（培养基配方见4.2.1）
4.1.2　耳片分离法：选无杂菌污染，黑厚大鲜耳，经无菌水冲洗几次，在无菌条件下，切取耳肉中间层（髓层）菌肉，接入试管斜面培养基上，在25℃～28℃温箱中培养长出菌丝体，再经纯化转管即成。
4.1.3　耳木分离法：选产耳多、生长快、健壮、无杂菌的耳木晾干后，在无菌条件下，选取带有菌丝的耳木片，移在平板培养基上，在25℃～28℃下培养，再经提纯，挑取健壮菌丝接在斜面培养基上，培养成熟后，再扩大繁殖。
4.2　母种的制作
4.2.1　培养基配方：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、KH2PO43g、MgSO41.5g、水1000mL。
4.2.2　制作方法：马铃薯削皮挖去芽眼，称200g，洗净切成碎快，入锅内加水1000mL，加热煮20min（水开后计时，切忌煮烂），取出用6层纱布过滤，取其汁液；再入锅煮，补足水1000mL，同时加入其它配料，边加热边搅拌，使之溶解均匀，趁热分装试管中。防止管口沾上汁液，用棉栓封实管口。每7支～10支用胶皮圈扎成一捆，并在管口部用牛皮纸包好，防止棉栓受潮或脱落。
4.2.3　灭菌：用手提式高压锅，加水至淹没支架，将试管直立装入内层锅里，盖严锅盖加热，当气压上升到0.035Mpa时，开排气阀放冷空气，待压力指针下降到0℃，大量冷空气排尽后，再关闭排气阀门，继续加温，在115℃（0.069MPa）压力下，灭菌30min即停止加热，自然降温，待指针下降到0℃后，打开锅盖，取出试管，趁热放在桌面横木棍（棒）上，摆成占试管长度1/3的斜面冷却备用。
4.2.4　接种
4.2.4.1　消毒：使用前先用紫外线灯照射接种箱(室)30min，再用2%来苏儿喷雾降尘后，即可接种（必要时可用10mL/m3甲醛，加6g高锰酸钾自燃熏蒸消毒）。
4.2.4.2　接种准备：接种人员进入缓冲室，更换工作服、帽、穿拖鞋，洗手后，即可入接种室进行接种。
4.2.4.3　接种方法：将母种和待接试管放进接种箱内，点燃酒精灯，用75%酒精棉擦洗双手和接种工具，在灯火上方接种。拔掉棉栓后，用火焰封试管口。先将工具放在灯火上方烧燎片刻，并插入试管口内冷却片刻，迅速挑取一小块菌丝体，接入另一支试管培养基中间，用火焰燎一下棉栓并封实管口，再接下一支。
如用超净工作台接种，一般开机后30min，使作业区空气净化，方可接种。
4.2.5　培养：将接好种的试管，放入恒温箱中25℃±1℃培养。
4.2.6　储存：将长满白色菌丝的试管，放入1℃～4℃冰箱中保存。
5　原种的制作
5.1　洗净菌瓶：用小口颈白色透明瓶，先用碱水洗净，再用清水冲洗控干备用。
5.2　培养基配方：阔叶木屑79%、新鲜麦麸或米糠20%、碳酸钙或硫酸钙1%。含水率60%左右。
5.3　配制方法：清除木屑中杂物、树皮，再将各种配料混合拌均匀，加水，使料中含水率均达60%左右。
5.4　装瓶：将培养料及时装入白瓶中2/3量，下松上紧，中间直扎一孔，加棉栓封瓶口。
5.5　灭菌：将装好料的菌瓶放入铁筐中，搬进高压锅内灭菌，在123℃（0.118MPa）压力下，连续60min～90min即好。如用常压锅，在100℃（上大气时，用温度计测温记时），持续7h～8h以上即可。
5.6　冷却：搬进冷却室内冷却降温28℃以下备用。
5.7　接种：同4.2.4。所不同的是，将母种接入原种瓶培养基中间孔穴里及孔穴口面上，加棉栓塞紧。
5.8　培养：将原种瓶放在培养室架子上，在25℃～28℃下培养15d～30d。每周检查1次，淘汰污染者。
5.9　保存：放入5℃～8℃储存室内，在卫生、干燥、无光环境下保存。
6　栽培种的制作
6.1　培养基配方：同5.2。
6.2　配制方法：同5.3。
6.3　装瓶（或塑料袋）
6.3.1　菌瓶：用广口瓶，或用17cmX33cm聚乙烯或聚丙烯塑料袋，事先用清水洗净备用。
6.3.2　装料量：每瓶（袋）装0.9kg±0.1kg湿料。
6.3.3　装料方法：用装瓶装袋机或人工装料，压实压平至瓶颈下，中间扎一孔穴到瓶底，加棉栓塞紧。如用塑料袋，装满袋后，压实压平到袋子2/3处，中扎一孔接近袋底，上粗下细，加棉栓或专用盖子封严袋口。
6.4　灭菌：同5.5。
6.5　冷却：同 5.6。
6.6　接种方法：同5.7。所不同的是，原种瓶横放小木架上，灯火封瓶口，挖出原种2勺～3勺，接入瓶子或塑料袋扎眼里及眼上，加棉栓塞紧即可。
6.7　培养：同5.8。
6.8　保存：同5.9。
7　菌种质量：
7.1　母种
7.1.1　目测：斜面正面外观，菌丝洁白，细毛状，毛短整齐均匀，无拮抗线，无杂菌污染。长满斜面时，背面常生米黄色或茶褐色色素，使培养基染成褐色或暗褐色 。但绝对不准有绿、黄、红、黑、灰等色 霉菌和粘状细菌菌落。
7.1.2　镜检：在显微镜下观察，菌丝体无色透明，有分枝和锁状联合。
7.2　原种
7.2.1　目测：菌丝体纯白，整齐、粗壮，培养料内外发育均匀。有时上方出现菌膜呈微褐色，或瓶壁内出现胶质原基，为淡褐色至黑褐色。但不准有绿、黄、红、黑、灰、等色的霉菌和粘状物。培养料紧贴瓶壁，平底无积液，瓶壁完整卫生。菌种容量：瓶装原种为230g±10g。
7.2.2　镜检：菌丝体分枝，交织密集，无色透明，粗细不匀，有锁状联合。
7.2.3　做出耳试验：每批产品随机取样，做出耳试验。检查菌种出耳质量及产耳特性。
7.3　栽培种：目测、镜检、做出耳试验同原种。
8　菌种的包装与标志
8.1　母种：每支母种要塞紧棉栓，防止脱落，另用牛皮纸包好扎紧，再用纸张将整个试管扎紧。要逐支注明：菌号（名）、厂名、生产日期、保质期、产品标准号。外面标明：防压、防潮、防冻、防倒置等标记。
8.2　原种及栽培种：每瓶（袋）菌种口部带棉栓，并用纸张包紧，装箱。箱外注明：菌号（名）、厂名、厂址、生产日期、保质期、数量、净含量、合格证等。还要标明：防压、防潮、防曝晒、防倒置标记。