液体菌种制作相关关键技术总结

春雨菌业

　近年来，食（药）用菌的液体菌种的利用成为发展趋势，这项技术已被部分人掌握，但很多人对该项技术还缺乏深入了解，理论上吃不透，实践上更没有经验，部分食用菌工厂化生产的企业和规模较大的菌种场正在涉足液体菌种的生产，但因为技术的原因或设备原因失败者为数不少，成功运用的也是部分较大企业。笔者根据几年来的液体菌种制作实践总结了液体菌种制作的关键技术，供参考。　　1、设备问题
　　全国生产液体菌种设备的有多家，有些设备可操作性强，有的可操作性较差，一般用户技术不太熟练就容易造成失败。据我们多年的液体菌种指导的实践看，一套优良的设备要有良好的空气过滤系统、灵敏的温度控制系统、快速冷却系统、停电保护装置，耐高压精加工的罐体等组成。空气过滤系统要有粗过滤器，气泵、总过滤器、3－4级精过滤器组成。3－4级过滤器要能经得起高温高压，便于灭菌。呼吸器也要经得起高温和高压。温度控制系统要有温度控制仪表和传感器，要有相匹配的电加热管或气源。冷却装置要做到快速冷却，进入下一级时温度降至28℃以下。
　　2、培养基问题
　　2.1　食用菌培养基中营养物质的浓度及营养物质的浓度比例适宜时，食用菌才能良好的生长。营养物质浓度过低不能满足食用菌正常生长的需要；营养浓度过高，不但造成浪费，由于渗透压过大，还会对食用菌生长有抑制或杀伤作用。同样，培养基各种营养物质的比例关系是影响菌丝生长繁殖、代谢产物形成和积累的重要因素。各种营养成分比例中最重要的是碳源与氮源的比例。即碳氮比（C:N），碳源不足菌丝体易衰老和自溶；氮源不足，菌丝会生长过慢，但碳氮比太小，食用菌会因氮源过多易徒长，不利于代谢产物的积累。
　　2.2　要有合适的碳源和氮源。要根据不同的品种调节适宜的PH值，还要有适宜的粘稠度。不同的菌种对碳源的种类要求及利用不一样，但大多数药用真菌都能利用葡萄糖、麦芽糖，蔗糖和淀粉。如香菇最佳碳源是蔗糖和红薯淀粉。最佳氮源是酵母膏、豆饼粉，蛋白胨次之。香菇生长期最佳的氮源是复合氮源。其比例是：豆饼粉:酵母膏:蛋白胨=1:1.5:0.2。
　　2.3　不同的品种适宜的PH值范围不同。通常调控PH有以下几种方法：①、配制合适的培养基，调节培养初始PH至合适的范围，并使其有很好的缓冲能力。②、培养过程中加入非营养基质的酸碱调节剂如CaCO2，或氨水或生理酸性物质。③、将PH控制与代谢调节结合起来，通过补料来控制PH。
　　2.4　培养基粘度越大，菌球越小，刺毛越短。但粘度不能过大。在培养过程中接种量越大，菌球越小，接种量大时通常可以分散的生长，而接种量小时，则有利于菌丝球形成。搅拌速度快、通气量大时菌球小，搅拌速度慢通气少时菌球直径大。
　　3、液体菌种的生长繁殖规律
　　食用菌液体菌种生长分为四个阶段，即缓滞期、指数生长期、稳定期和衰亡期。
　　3.1　缓滞期。其特点是，生长速率常数为等于零，菌体体积增长速度较快，胞内贮藏物质逐渐消耗，DNA和RNA的含量也相应提高，分裂迟缓，代谢活跃。在这一时期细胞正在为下一阶段的快速生长与繁殖作生理与物质上的准备。缓滞期的长短因菌种、菌龄和培养条件不同而异。
　　①、接种龄即接种物的生长年龄，它的生长期状况处于生长期的哪一阶段。菌种处于指数生长期时，子代培养物质缓滞期短。处于缓滞期或衰亡期的子代培养物的缓滞期长。处于稳定生长期的培养物缓滞期处于以上两者之间。
　　②、接种量，接种量的大小可明显影响缓滞期长短，接种量越大缓滞期越短。
　　③、培养基成分，营养丰富的缓滞期短，反之则长。
　　3.2　指数生长期。液体的摇瓶种子被接入到发酵罐中，经一段时间适应，即进入指数生长期 。此期特点：生长速率最大，细胞分裂一次所需要的代时（G）较短，菌体大小形态生理特征比较一致，酶系活跃，代谢旺盛，活菌数与总菌数接近。
　　3.3　稳定期。随着细胞的不断生长繁殖，培养基中营养物质的逐渐消耗，代谢产物形成，使细胞的生长速度逐渐下降，此时细胞的繁殖速度与死亡速度相等，即生长速率常数为零。细胞的总数达到最高点。此时称为稳定生长期。此期特点是；活菌数稳定，总菌数达到最高水平，以代谢产物质合成与积累为主，代谢积累达到最高值。
　　3.4　衰亡期。达到稳定生长期的菌群，由于营养物质的短缺，群体中的细胞死亡率逐渐上升，以致死亡菌数超过新生菌数，群体中的活菌数下降，出现了“负生长”曲线下跌。此期特点：菌体细胞形状和大小出现异常，甚至畸形，菌体发生自溶。
　　4、不同发酵阶段的培养条件
　　4.1　缩短缓滞期的措施和培养条件。以指数生长期的种龄接种；适当加大接种量，可达20%以上。采用较为丰富的培养基。最适的培养条件：大多数食用菌的培养温度为24－27℃，低罐压0.015－0.025Mpa，较少通气量。
　　4.2　指数生长期的培养条件。较大通气量，培养温度为23－24℃度，罐压0.025－0.045Mpa。
　　4.3　稳定期的培养条件。在此阶段的如果急用菌种就可直接利用。如果条件限制的话就可采取降温措施，适量通气，稳定罐压。温度22－23℃，罐压0.03－0.04Mpa。
　　4.4　衰亡期控制措施。尽可能低温培养，适时结束发酵。少量通气，较低罐压。
　　5、发酵罐空消与培养基实消
　　5.1　发酵罐空消。主要是应用高温、高压蒸汽对空气过滤器、输料管道，呼吸器等部位的灭菌。一般压力达0.11Mpa，温度达121℃，时间40min即可。在此过程中要不断地微放气，以防产生灭菌死角和产生冷凝水。灭菌结束后系统还要保持正压力。
　　5.2　培养基实消。培养基实消就是在罐压0.11－0.14Mpa，温度121℃以上，灭菌40min对培养基的灭菌，结束后保持罐压在0.02－0.04Mpa。同试管制作灭菌方法一致。
　　6、检查污染
　　6.1　检查方法。采用先闻后看再取样的方法检查污染情况。培养二天后可以闻尾气味道。正常是无异味。细菌污染有酸味，异味，霉菌污染有酒味。菌丝球增加较快为正常。不增加有可能污染了杂菌。可在接种后第4天取样，在火焰保护下，通过取样阀门，将样液取到无菌瓶内。再在超净工作台上，将样液接入空试管培养基上。于32度条件下培养24h，观查有无细菌等感染。
　　6.2　污染原因。造成污染的主要原因有：①、种子有杂。②、接种时压力回零进了气。③、培养基灭菌不彻底。④、空气系统消毒不好。⑤、泡沫冒顶。⑥、蛇管穿孔。⑦、接种管穿孔。⑧、阀门泄漏。⑨、操作失误。
　　6.3　染菌分析
　　6.3.1　大批量发酵罐染菌，在生产中，不同罐批都出现染菌，而且是同一种杂菌，这时应考虑空气系统出了问题。可能是过滤器失效造成的。
　　6.3.2　个别发酵罐染菌，原因阀门渗漏、发酵罐管件有死角、过滤介质失效。
　　6.3.3　从染菌时间分析。发酵罐早期染菌可能是种子带杂或设备灭菌不彻底。发酵中期或后期染菌可能是中间补料或设备渗漏及操作失误有关。
　　6.3.4　从染菌类型分析。如污染球菌、杆菌或酵母菌等可能因为蒸汽的冷凝水或空气系统泄漏。污染霉菌大多是灭菌不彻底，因为泡沫的增多，泡沫中的空汽和泡沫的薄膜有隔热作用，不易把耐热细菌杀死。一旦泡沫消泡，这些细菌造成污染。
　　7、发酵终点的确定
　　确定发酵结束，开始利用的时间要根据生产计划和菌龄来确定，菌种成熟的主要指标是，菌丝体形态成为多而小的菌丝球，发酵结束取样时PH值不致过低。放置10分钟，发酵液与菌丝球不分层，菌丝球呈悬浮状，密度较大，发酵液变清即可开始应用。