某工厂摇瓶菌种死亡或不生长原因分析
摇瓶菌种是从试管母种到发酵罐培养的中间阶段。成品率的要求同试管母种一样，是要求必须100%的。
一般来说，摇瓶菌种的培养相对于发酵罐培养来说，环境优良，影响因素明确，可控性强，是比较简单的。
正是因为简单，往往在操作中疏忽某些因素和变量，长久持续的做精做好就不容易。
平时注意做好基础功夫，学习一种分析问题的思路，比直接得到标准答案 更能学到知识。
下面介绍作者参与分析某厂的具体事例，摇瓶菌种不成活的问题，分享一下分析问题的思路。
某厂是应用液体菌种进行黑木耳菌包工厂化生产。日产10万袋，平均日制作发酵罐3罐。菌种技术员有一定的基础知识和生产经验，前期该厂，摇瓶菌种已生产两个来月，制作摇瓶200来瓶，全部正常。
而在3月初期，前后相隔不久，有两天的摇瓶，发现摇瓶菌种异常，接种块不成活。因为是摇瓶菌种，事关重大，需要紧急解决问题。
经仔细询问，一起探讨，把所有的相关因素全部排查，排查环节和改变方案如下:
1 试管母种，操作标准，检查严格，确定本身无污染。硅胶塞封口 冰柜存放两个月，活化时有遇30多度高温，或者有冷凝水。
检验方案:马上制作一批细菌检测试管，转管培养，同时，把转接摇瓶以后的剩余试管28度恒温培养观察。
2 配方，无改变。水，重测pH值。pH7左右，中性微酸。
3 培养基装瓶方法正确无误。棉塞方面，棉塞重复使用，有嫌疑。拆开棉塞观察，棉花洁净，干燥。松紧合适。
棉塞问题，大概排除。为保障起见，每批换新棉花，重做新棉塞。
4 灭菌，排气基本能保证彻底，冷却阶段，不十分确定，因人员紧张，忙于别事，有自然降压到零，瓶内形成负压倒吸的可能性。
改进计划是:仍旧执行老工艺:排冷气5分钟，灭菌结束后，人工值守降温，锅内略有压力时，缓慢泄压放气，绝对保证内部微正压，严禁负压。
5 接种设备。超净台，初期检测合格，超过一个月未做杂菌检测，超过一个星期未做全面擦洗消毒。
此处是风险因素之一，改变办法是:每次操作结束全面酒精擦洗一次，结合紫外线照射消毒30分钟，一个星期做一次 平板检测。
立刻做平板检测，动态下，做2个批次平板检测，结果: 菌落合格。
6 操作手法。程序无改变。但有遇突发情况，当时没注意。有几天气温升高，实验室室温较高;操作手法也有细微改变，接种工具消毒时间可能有延长，而冷却时间没有相应延长，有造成烫伤菌种的可能性。
改变办法是:延长在无菌环境下的工具冷却时间。确保冷却完全。
7 操作不规范或工具消毒不彻底造成的污染:可能性极微。不萌发的培养液pH正常，气味无异常，无异味。因污染造成抑制菌种的可能性也较低。
8 同期制作3瓶，有一瓶萌发正常，间接说明母种正常。未萌发的菌种块表面光滑，无菌丝生成，颜色乌黑灰暗同斜面培养基一个颜色。
转接细菌培养基检测的菌种样品，和剩余菌种培养，萌发正常，菌种本身的原因基本排除。
但为保障起见，立刻转接新试管，冰柜保存的菌种，控制在两个月以内。
9 培养:有高温现象。因气温升高，室温也相应升高，加温空调测温不准，室内实际气温短期内超过30余度，实测摇瓶间隙，和培养液温度更高 是不利因素之一。
改变办法是:把恒温室加热空调关闭，或维持在室温20度，仍用恒温箱，培养温度严控在适宜培养温度。
10 培养环境:每天消毒液擦洗地面，定时紫外线照射，加强培养室和实验室环节消毒。
分析结果，主要怀疑接种工具和冷却不彻底而烫伤菌种。但同时其他环节也有相应风险因素。因为生产紧迫，没法做单因素分析，只能综合改进。按改进后的程序，继续做几十个批次，完全正常。
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发表于 2019-3-31 22:53:50
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