食用菌液体菌种发酵终点的简便检测方法

春雨菌业

林增祥1’2，付永前1’2，曾宪贤1.2*(1.新疆大学离子束生物工程中心，乌鲁木齐830008; 2.新疆大学物理系，乌鲁木齐830046)

　　食用菌液体菌种具有生产周期短，菌龄一致，菌种成本低，接种简便，便于管理，易于实现工业化、标准化生产的优点，越来越多的人在研究和使用液体菌种。为了取得较高的经济效益，采用各种诱变方法筛选出优质高产菌株，然而在液体菌种的筛选过程中，对摇瓶中菌株生长情况及时做出判断为深层发酵提供工艺参考数据，成为液体发酵放大的关键技术之一。传统的判断方法可以通过培养液气味检查、菌液澄清度及颜色变化、菌丝体形态观察、菌丝(球)的浓度状态、酸碱度测定、含糖量测定等，需要用到很多仪器和试剂和时间，而且被检测发酵液，很难再进行后续培养和分析。本文对经过N锈变后筛选得到的阿魏菇高产菌株进行摇瓶发酵试验，以液体摇瓶中发酵液质量变化为参数，可以对发酵终点同步作出判断，操作简单，仅用天平作为仪器，累计观察时间少，不影响后续接种培养，同时可以为食用菌发酵放大生产提供数据参考。
　　1　材料与方法
　　1.　材料
　　1.1.1　菌株　由新疆大学离子束生物工程中心提供
　　1.1.2　培养基
　　1.1.2.1　固体培养基　小麦粉3%、麸皮3%、蔗糖2%、KH2P04 0.2%、NaCl 0.3%、MgS04 0.15%、酵母膏0.5%、阿魏粉3%、琼脂2%, pH值7.00。
　　1.1.2.2　液体发酵培养基　小麦粉2%、麸皮3%、蔗糖2%、蛋白陈0.2%、KH2P04 0.2%、NaCl 0.3%、MgS04 0.1%、酵母膏0.4%、阿魏粉3%,pH值7.0。
　　1.2　实验仪器与设备
　　P270型普通摇床，JY5002精密分析天平1/105, 101A-1B电热鼓风干燥箱，PHS-3C型精密pH计。
　　1.3　实验方法
　　1.3.1　制备过程
　　将诱变菌种接人斜面培养基，放入培养箱中培养2-3d。挑选出菌丝生长最快的菌落继续转接平板，经过多次转接传代后基本稳定。
　　转接摇瓶以菌丝长满整个斜面为止，此时菌丝正处于旺盛的生长期。在无菌条件下，再将菌丝体接种于摇瓶中，500mL摇瓶，装液量100mL;250mL摇瓶，装液量80mL，置于旋转式摇床中，转速200rpm, 30℃下恒温振荡培养，每隔12h称量一次诱变阿魏菇摇瓶质量，记录数据，观察菌丝球生长状态，5d后结束摇瓶培养。最后，将摇瓶所得的发酵液进行抽滤，得发酵上清液测量pH值，菌丝体70℃烘干12h后称量菌丝质量，以确定是否染菌。
　　　　　　　　表1 菌落直径数据记录
　　　　　1d　2d　3d　4d　5d　6d　7d　8d　9d　10d　每天平均　
原始菌株　1.6 2.4 3.1 3.8 4.6 5.3 6.0 6.8 7.4　8.2　0.7
诱变菌株　1.5 2.8 4.3 5.6 7.4 8.5　　　　　　　　　 1.5
　　1.3.2　数据处理，计算公式
　　A=M 接种发酵液/M空白发酵液=(M测量-M摇瓶-M塞子)/(M测量-M摇瓶-M塞子)
　　M接种发酵液:接种发酵液质量　M空白发酵液:不接种发酵液质量

表2　诱变菌株分别接250mL,500mL摇瓶每夭质量记录

　　　　　　　0d　　　0.5d　　1d　　　1.5d　　2d　　　2.5d　　3d　　　3.5d　　4d　　　4.5d　　5d
------------------------------------------------------------------------------------------------------------
250mL(空白)　174.34　173.77　173.08　172.65　172.06　171.59　171.13　170.72　170.29　169.76　169.25
250mL(接种)　200.34　199.70　198.91　198.46　197.74　197.07　196.43　195.82　195.25　194.74　194.32
500mL(空白)　290.06　289.29　288.49　288.16　287.71　287.26　286.80　286.44　286.04　285.59　285.18
500mL(接种)　277.38　276.52　275.52　275.09　274.54　274.03　273.45　272.95　272.54　272.11　271.88
　　2　结果与讨论
　　2.1　筛选出诱变菌株与原始菌株在平板的长势比较
　　由表1可见在平板上诱变株菌落生长速度快，6d长满平板，平均生长速度是原始菌株的2倍多。
　　通过图1中250mL,500mL摇瓶质量变化比值，参照图2微生物典型生长曲线，可知在指数生长期，发酵液内菌丝新陈代谢一直加快并释放出C02等气体与之同步摇瓶的质量减少加快。当出于稳定期时，微生物新陈代谢趋于稳定，由于养分消耗代谢减缓，发酵液粘度增加等因素，质量变化减缓，即表2中第4d，图2中第9次记录的拐点处。当诱变菌株处于衰亡期时，活菌数减少新陈代谢减小，质量变化曲线开始上升，即表2中第4, 5d，图2中第10次记录以后，因此可以得到诱变菌株液体摇瓶的发酵周期为4d。
　　2.2 500mL液体摇瓶发酵结束后测干菌丝质量和pH值
　　由表3可见，通过以上方法在液体摇瓶发酵试验中，诱变菌株发酵4d后菌丝烘干质量和原始菌株发酵10d后菌丝烘干质量相差不大，pH值约为4.5左右比原始菌株6.6要低，发酵周期为4d比原始菌株10d大大缩短。
　　3　结论
　　综合上述试验结果，可以得出:通过N+注人诱变方法筛选得到的阿魏菇菌株与原始菌株相比较，具有生长速度快，发酵周期短，如果采用工业化常年规模生产阿魏菇菌丝体做生物工程下游提取，与子实体相比具有效率高、成本低的优点，因此采用阿魏菇的液体深层发酵法，在阿魏菇有效成分提取产业化方面具有很大的发展前途。
　　同时可以为其它微生物菌种的选育过程中，液体发酵终点判断提供一个简便方法。
　　参考文献：略
　　甚金项目　国家发改委高技术产业化示范工程项目(发改高计【2004]2077)
　　作者简介　林增祥(1980-)，男，新疆省乌鲁木齐市，硕士研究生，从事民用非动力核技术及其应用研究。
　　*通讯作者E-mail: xian@xj.cninfo.net