灰树花液态发酵转化米糠制备多糖的研究

春雨菌业

　　灰树花( Grifola frondosa)是一种珍稀的食、药兼用真菌。近年的研究和实际应用表明食用菌多糖及其富集的有机微量元素对提高人体的免疫力有作用，可用于人体保健。国际上新西兰皇家科学院高益槐研究团队推出复合活性多糖产品。国内有关灰树花、猴头菌、灵芝等产品也陆续推出。这些产品的市场价格较高。例如高益槐的科研成果转化的名称为“Ganopoly”的提高免疫力的多糖复合产品，由相应的食用菌子实体提取，每600mg的胶囊约15元左右。推荐每天服用5粒左右，每年至少使用6个月，约需1万多元。如能采用液态发酵的方法快速生产食用菌多糖并对工艺进行改革，就有希望降低产品的价格。正因为如此，就灰树花研究而言，国内江南大学、江苏大学等单位对灰树花液态发酵产多糖和富集微量元素都进行过研究，得到各种结论。在已有的一些研究中虽然也使用了部分米糠，但不是以米糠为主，同时使用了其他的碳源物质，如较多的葡萄糖等。本研究则选择米糠为主要培养基，少用葡萄糖等碳源。为此需要有适性菌种，适宜的工艺。课题组曾经对灰树花出发菌株进行紫外诱变，挑选出适合于以米糠为主要培养基成分的适性菌种。本研究将以此为出发点，以产灰树花多糖为目标，进一步研究以米糠为主的培养基的筛选，希望提高米糠的利用价值，减少葡萄糖等的用量，降低生产成本，为灰树花工业化转化米糠生产灰树花多糖提供理论依据。　1  材料、设备、方法和试验设计
　　1.1  试验材料和设备
　　HANGPING JA2003电子天平，上海仪器仪表厂；SHJ超净工作台CA-480-Ⅱ，上海汇龙公司；数显生化培养箱，常州国华电器有限公司；DH2-D冷冻恒温振荡器，江苏太仓试验设备厂；DHG-9245A型电热鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司；UV-1601紫外／可见光分光光度计，北京瑞利分析仪器公司。
　　灰树花菌种为米糠培养基上的诱变菌种；米糠为镇江市米厂提供；马铃薯为市售；所用试剂均为上海化学试剂公司提供。
　　1.2　试验方法
　　1.2.1　培养基的配制
　　(1)　固体培养基（PDA培养基）
　　马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75g/L，维生素B1 lOmg/L，蛋白胨5g/L，琼脂20g/L。pH值自然，0.1MPa（表压强，以下同）条件下高压灭菌30min。
　　(2)　液体种子培养基
　　马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75g/L，维生素B1 10mg/L，蛋白胨5g/L。pH值自然，250mL锥形瓶中分装100mL培养液，0.1MPa条件下高压灭菌30min。
　　(3)　液态发酵基础培养基
　　除去葡萄糖、蛋白胨，其余同液体种子培养基。由本研究的图1的空白试验结果知，基础培养基中添加马铃薯效果并不理想。可以考虑去除。
　　(4)　发酵培养基
　　液态发酵基础培养基，另加葡萄糖、米糠、蛋白胨，根据试验要求进行添加。
　　1.2.2　培养方法
　　(1)　碳源利用试验和葡萄糖浓度试验
　　碳源利用试验：在液态发酵基础培养基中加蛋白胨5g/L，再分别加2%的葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、米糠汁。与液态发酵基础培养基加蛋白胨5g/L对照，在250mL锥形瓶中装入100mL培养液，灭菌后接入10%液体种子，28%，150r/min摇床振荡培养5d后，测量菌丝干重和菌丝多糖（即胞内多糖）含量。葡萄糖浓度试验：除用不同浓度的葡萄糖外，其余同碳源利用试验，测量菌丝多糖产量。
　　(2)　氮源利用试验
　　在液态发酵基础培养基中，加入2%葡萄糖。氮源分别为不加氮源（对照）、0.5%的蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、豆粉。培养方法和条件以及分析项目同碳源利用试验。
　　(3)　正交试验
　　在液态发酵基础培养基中加入所需的各因素各水平的物质，其余同(1)，测量菌丝多糖产量。
　　1.2.3　测定方法
　　(1)　菌丝干重的测定
　　将发酵所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤2-3次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60℃条件下干燥至恒重，经电子天平称量即得菌丝干重。
　　(2)　菌丝体多糖的测定
　　湿菌丝体中加入5倍体积蒸馏水，经研磨后，在80C水浴中浸提3h，3 000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后经过旋转蒸发使滤液浓缩到原体积的1/3，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖。在4℃的冰箱中醇沉12h以上，经离心、冷冻干燥，用苯酚一硫酸法测定。，
　　由于胞外多糖的测定有可能受培养基成分的影响，本研究主要以菌丝多糖产量作为考察指标。文献表明，灰树花胞外多糖与菌丝的生长和菌丝多糖有一定的正相关性。
　　2　试验结果与讨论
　　2.1  液态发酵培养基的优化
　　2.1.1  碳源对菌丝干重及多糖含量的影响
　　由图1可知：不同碳源对灰树花菌丝生长和多糖产量的影响作用各异。当以葡萄糖为碳源时，菌丝生长情况最好，菌丝得率最高，为1 238mg/100mL；同时，菌丝多糖含量也最高，为226mg/lOOmL。其次，米糠和果糖也是较好的碳源，因为米糠为农副产品，价格低廉，从试验分析结果可以看出，在生产上可以用米糠替代葡萄糖作为碳源，以降低生产成本。因此，在综合考虑成本、菌丝得率和多糖产量等因素的情况下，碳源采用葡萄糖和米糠组成的复合碳源为宜。根据试验目标要少利用葡萄糖，多利用米糠。由图1也可知，只含马铃薯的基础培养基在液体深层发酵时效果不佳，碳源不足，需要添加其他碳源，可以考虑不用马铃薯，而直接用米糠替代。试验证明选择米糠作为替代碳源有其合理性。
　　2.1.2  氮源对菌丝干重及多糖含量的影响
　　由图2可知：不同氮源对灰树花菌丝生长和多糖产量的影响作用各异。当以蛋白胨、酵母膏、牛肉膏作为氮源时，因其为有机氮源，可以直接被菌丝体利用，促使灰树花菌丝生长情况好，菌丝得率和多糖产量高。其中，以酵母膏作为氮源时，其菌丝干重和多糖产量达到最大，分别为930mg/lOOmL和103mg/ lOOmL。由试验数据分析结果可知，蛋白胨和牛肉膏对多糖含量的影响作用比较相近。因此，从实际试验情况出发，选择蛋白胨作为灰树花液态发酵过程中的适宜氮源。灰树花生长需要一定的氮源，为以米糠为主的培养基组成提供适宜的氮源也有其必要性。
　　2.1.3　葡萄糖添加量对菌丝生长及多糖含量的影响
　　由图3可知：随着葡萄糖浓度的递增，灰树花菌丝产量和产多糖的能力在逐步递增。在葡萄糖添加量分别为2.0g/lOOmL和2.5g/lOOmL时，其多糖产量比葡萄糖添加量为0.5g/lOOmL时多135mg/100mL和224mg/100mL；其菌丝产量比葡萄糖添加量为0.5g/ lOOmL时多639mg/lOOmL和675mg/100mL。考虑少用葡萄糖，又要有较好的菌丝生长，选择葡萄糖添加量在1.5-2.0g/lOOmL为宜，作为灰树花液态发酵过程中培养基的组成部分。
　　2.1.4　不同米糠添加方式对灰树花多糖含量的影响
　　由图4可知：随着米糠汁添加量（米糠经过水提法处理后，经双层纱布过滤，取其滤液，即为米糠汁添加量）、全糠添加量（将米糠直接添加到培养基中，即为全糠添加量）、一次去汁后全米糠添加量（经过水提法处理后的米糠，经双层纱布过滤后，取其滤渣，为去汁全米糠添加）的增加，灰树花多糖含量的数值变化在lO-30mg/lOOmL范围内，相对差异小于25%，菌丝多糖的绝对值在120-155mg/lOOmL范围内。说明米糠在使用方式上总体会带来差异，但不是很大。5%的米糠添加量发酵所产的菌丝多糖为154.8mg/lOOmL，2%的葡萄糖添加量发酵所产的菌丝多糖200 mg/ lOOmL。因此，可以比较得出米糠有可能替代葡萄糖。
　　2.2　正交试验优化培养基组成
　　由以上单因素试验结果可知，灰树花液态发酵过程中，培养基的组成首先分别选取米糠汁、葡萄糖、蛋白胨作为考查因素，进行L9 (34)的正交试验。正交试验结果见表1。
　　对试验结果进行极差分析，葡萄糖、米糠汁、蛋白胨的多糖含量均值分别为281、240、168；223、258、209; 221、229、239。极差分别为113、49、18。得到以多糖含量为指标的最优碳、氮源组成：A lB2C3，即葡萄糖为1.5%，米糠汁为6%，蛋白胨为0.4%。葡萄糖、米糠汁、蛋白胨的菌丝干重均值分别为1 309、1 267、1163; 1250、1 285、1205; 1266、1 198、1 276。极差分别为146、80、78。得到以菌丝干重为指标的最优碳、氮源组成：A IB2C3，即葡萄糖为1.5%，米糠汁为6%，蛋白胨为0.4%。综上所述，葡萄糖是影响菌丝生长和多糖产量的主要因素，其次是米糠，蛋白胨的影响作用最小。
　　以多糖含量为指标，葡萄糖、米糠汁的F值经过合并最小方差后计算分别为27.58和5.43。当置信度o取0.05时，F(oos,2,4)--6.94，置信度o取0.01时，F(OOl,2,4)--18-00。由方差分析试验结果可以看出，葡萄糖的影响作用高度显著，其他因素的影响作用不显著。因此，以Ax（即葡萄糖因素）的1水平1.5%的菌丝多糖的平均值281.3mg/100mL作为菌丝多糖的最优值比较可靠。平均值比只添加1%的葡萄糖菌丝多糖值74mg/100mL增加了280%，比只添加1.5%的葡萄糖菌丝多糖值108mg/100mL增加了160.5%，比只添加2%的葡萄糖菌丝多糖值200mg/100mL增加了40.7%，所以米糠的添加是必需的。综合得出结论：少用葡萄糖(1.5%)，多用米糠(5%~6%)，可以获得菌丝多糖约为281.3mg/100mL，米糠的作用在正交试验中不显著，是由于水平范围选值太窄所致，如不添加米糠，上述增加的百分数将不能达到。以菌丝干重为指标，葡萄糖的F值经过合并最小方差后计算为3.0。当置信度o取0.05时，F(0.05,2,6) =5.14，置信度o取0.01时，F(。。，，：，。)=10.92。由方差分析试验结果可以看出，三个因素对菌丝产量的影响作用都不显著。说明在所选的各因素的水平范围内，菌丝的指标数值变化分不出是试验误差引起还是因素的水平变化引起。因此，以9次试验的平均值评价比较合理。9次试验葡萄糖的用量范围为1%-2%，米糠的使用范围为4%-6%。9次试验菌丝的平均产量值为1 246.7mg/100mL。
　　3　结论
　　(1)　在葡萄糖添加量、米糠添加量单因素试验的基础上，对培养基组成的葡萄糖添加量、米糠添加量和蛋白胨添加量之间进行L9 (34)正交试验，最终获得灰树花基础发酵培养基的额外添加碳源、氮源组成为：葡萄糖为1.5%，米糠为4%-6%。可信的菌丝多糖平均值为281.3mg/100mL。并分析得出少用葡萄糖(1.5%)，多用米糠(4%~6%)，可以获得菌丝多糖约为281.3mg/100mL。菌丝产量为1 246.7mg/100mL。米糠的使用方式对菌丝多糖产量的影响小于25%。
　　(2)　用试验论证了米糠替代葡萄糖生产灰树花多糖的可行性，为后续进行工业化生产，降低生产成本提供了一种可行的思路。

顾慧敏  刘伟民  张  建（江苏大学食品与生物工程学院）　粮油加工2010.5　转自上海农业网