共生食用菌松茸菌丝体液体发酵的研究

春雨菌业

　　摘要：目的研究松茸菌丝体液体发酵方法和最佳条件。方法经RAPD-PCR 分析确认松茸菌丝体菌种，研究松茸液体深层发酵过程中菌丝体的生物量、残糖浓度和pH随时间变化的过程；比较不同种龄对菌丝体积累的影响，确立最佳接种种龄；比较不同初始糖浓度发酵过程的结果，运用中间补糖的方法，确定最优的补糖时间。结果最佳接种种龄为6 d；初始糖浓度较低有利于缩短松茸种子液生长的延迟期，较高则可使菌丝体在较长时间保持生长并获得较高的生物量产出。d 12 为最优补糖时间，在摇瓶体系中培养24 d最终得到12.77 g/L的菌丝体生物量。结论最佳培养条件下，采用中间补糖法适合液体发酵过程中松茸菌丝体的积累。


　　松茸（Tricholoma matsutake）是与松树共生的珍稀食、药用外生菌根真菌，有很高的营养价值和特殊的药用效果。由于野生松茸资源已经日渐枯竭，人工培养尚无法获得松茸的子实体，因此液体深层培养松茸菌丝体，提取生理活性物质并进行深加工越来越受到关注。目前对松茸菌丝体培养的研究主要集中在松茸菌丝的营养生理、液体条件下培养基成分的优化以及培养条件的考察等方面[1-3]。本实验采用了经RAPD-PCR 分析确认的松茸菌丝体菌种，研究了松茸在摇瓶中液体条件下各生长参数的动态变化。发酵过程中采用中间补料的方法，获得了较高的菌丝体生物量，为大规模液体深层发酵生产提供了依据。
　　
　　1材料与方法
　　
　　1.1菌种来源
　　采集我国东北延边地区产的松茸子实体，经组织分离获得菌丝体。纯培养后，经RAPD-PCR（随机引物聚合酶链反应) 分析DNA进行亲菌鉴定，确认为松口蘑菌丝体菌种[4]。
　　1.2培养基
　　PDA 培养基用于斜面菌种培养。液体种子培养基（g/L）是葡萄糖20 , 酵母浸粉1，蛋白胨2，NH4Cl 1，KH2PO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，维生素B1 0.05，pH自然；发酵培养基（g/L）是葡萄糖（据实验要求而定），酵母浸粉2，蛋白胨2，KH2PO4 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，维生素B1 0.05，pH 5.0。
　　1.3方法
　　1.3.1培养方法液体种子培养：用直径10 mm的打孔器将生长旺盛的固体琼脂菌苔切成大小一致的菌块，接种灭菌后的液体种子培养基，菌块要薄以使其漂浮在液面上。用500 mL 三角瓶，装液量100 mL ，22 ℃，50 r/min条件下摇床避光培养。
　　发酵培养：用250 mL 三角瓶，装液量50 mL，液体菌种接种量10 %（去除种子培养液中的固体菌丝块和碎片），22 ℃，70 r/ min 条件下摇床避光培养。
　　取样测定：在每个取样期取3瓶样品做平行测定，以平均值作为测定结果。
　　1.3.2测定生物量40目尼龙滤网过滤培养液，分离菌丝体和发酵液。菌丝体经去离子水冲洗数次，60 ℃恒温烘干至恒重，分析天平称重。测定发酵液pH值及残糖浓度。
　　1.3.3测定残糖浓度费林试剂法每组平行测定6~8次后取平均值。
　　1.3.4显微观察菌丝体取发酵液于载玻片上，乳酸苯酚棉蓝染色涂片，光学显微镜下观察。
　　2结果
　　
　　2.1最佳种龄
　　以相同的接种和培养条件，分别选取种龄为6，9，11 d 的液体种子，接种于摇瓶发酵培养，测定发酵过程中生物量、残糖和pH的变化，结果见图1、图2。

　　
　　图1　种龄对菌丝体生物量和残糖变化的影响

　
　　图2　种龄对pH变化的影响
　　　　结果表明，种龄6 d的发酵液萌发稍晚但最终获得较高的生物量，发酵前6天菌丝体生长速度较缓，残糖下降不明显，从d 9开始菌丝体生长速度明显加快，发酵液中糖浓度明显降低，至d 18时菌丝体生物量达到最大值，其发酵液pH值下降慢；种龄为9 d、11 d的发酵液开始时菌丝体生长旺盛，残糖的大量消耗使pH下降较快。

　　液体种子种龄6 d时开始进入生长旺盛期，菌丝体在生长点时转接入营养更充足的发酵培养基，虽然开始时较种龄9 d和11d的生长量延迟，但最后有较高的生物量。种龄为9 d、11 d的种子接入后能很快适应环境生长，但接种时已处于生长旺盛期的中后期，菌丝易老化，到d 15左右生长就达平台期，菌丝体的量不再增加。因此选择最佳接种种龄为6 d。
　　2.2初始糖浓度对松茸生物量积累和葡萄糖消耗的影响
　　分别选取15，25，35 g/L3种葡萄糖浓度作为初始糖浓度，其他培养条件不变，考察初始糖浓度对松茸菌丝体生物量和葡萄糖消耗的影响，结果见图3。

　　图 3初始糖浓度对松葺菌丝生物量积累（A）和葡萄糖消耗（B）的影响

　　　　葡萄糖初始浓度35 g/L时，d 24菌丝体产量达到最大值8.91±0.26 g/L；初始浓度25 g/L时，d 21达到最大值8.07±0.37 g/L；初始浓度15 g/L时，d 18达到最大值7.09±0.32 g/L。从葡萄糖消耗动态过程（图3 B）可见，葡萄糖在d 6、d 9有明显的消耗。至发酵结束时（d 24），3组实验中残糖浓度都没有降到零点，最终残糖浓度分别为3.56±0.42，5.34±0.39和10.35±0.73 g/L。葡萄糖初始浓度为15 g/L的一组最终糖浓度有小幅回升。
　　实验结果表明，葡萄糖初始浓度较高最终可获得较多的生物量，但菌丝体生长延迟期较长，达到最大生物量所需的时间亦较长。较低的初始糖浓度可较快地达到最大生物量，但一定时间后（15 d），菌丝的生长随着残糖浓度的降低明显变缓，残糖浓度降到一定数值时菌丝停止生长。因此，实验设计为初始糖浓度较低，菌丝体进入生长旺盛期后，通过中间补加碳源维持发酵液中的糖浓度，使菌丝体保持较快的生长速度并获得较大的菌丝体生物量。
　　2.3补料时间对菌丝体生物量和葡萄糖消耗的影响
　　以15 g/L作为初始葡萄糖浓度，根据菌丝体生物量快速积累和残糖大量消耗的时间，分别选取d 12，14，16补糖，以考察不同补料时间对菌丝体生物量积累的影响。补加灭菌后的40 g/L葡萄糖溶液20 mL，并以不补糖的实验组作对照。菌丝体生物量和葡萄糖底物浓度的对比见图4。

图4补料时间对菌丝体生物量和残余葡萄糖浓度的影响

　　中间补加碳源后，菌丝体继续保持较高的生长速率，其最终生物量1组在d 24达到12.77±0.38 g/L；2组在d 27达到11.31±0.24 g/L；3组在d 27达到10.76±0.26 g/L。残糖浓度在补料后随着菌丝体生长以较快的速度下降，接近发酵终点时下降趋于平缓，最终分别达到3.29±0.29 g/L，3.89±0.42 g/L，5.23±0.36g/L。结果表明，中间补加碳源能使菌丝体保持较高的生长速率和菌丝体生物量 ；d 12时补加碳源较为有利，最终菌丝体生物量能达到12.77g/L。d 12时菌丝体生长处于生长旺盛期的中后期，尚未进入平台稳定期，对传质有很大影响的致密菌丝球尚未形成，此时补加碳源能使菌丝体继续保持高速生长的态势，延长菌丝生长旺盛期，最终达到较高的菌丝体量积累。
　　
　　3讨论
　　
　　为了缓解市场需求和有限的自然资源之间的矛盾，人们寄希望于通过液体深层纯培养方法获得松茸菌丝体。人工菌丝体培养的前提是获得松茸的菌种，由于松茸目前尚无法通过全人工方法完成其生活史，即无法培养出子实体，仅靠菌丝体形态、菌落特征难于准确确认分离物是否是松茸纯菌种。我们用的菌种是从野生松茸的子实体中分离得到，并经RAPD-PCR分析确定为原菌株的子代菌丝体。
　　松茸是与松树共生的外生菌根真菌，其菌丝体生长速度极为缓慢，在自然条件下，菌丝体以每年10～15 cm 的速度扩展[5]。在液体深层环境下，相对于其他成功发酵菌丝体的食用菌，松茸菌丝体的萌发生长十分缓慢，接种后一般需5~7 d才能观察到菌丝体萌发生长，所以确定接种种龄非常重要。此外，鉴于松茸菌丝体生长缓慢，本实验选择了速效的葡萄糖作为碳源，以期能在较短的时间内获得菌丝体的积累。考察残糖浓度随发酵时间的变化，几乎所有的实验在到达发酵终点时都未发现葡萄糖浓度到达或接近零点，初始糖浓度较高时最终的残余糖浓度也较高。结合取样测糖时菌丝体形态的观察结果，可能是由于临近发酵终点时，菌丝球已经形成，导致传质阻力增加，菌丝体停止生长，残糖浓度不再降低。我们通过中间补料的方法在摇瓶系统中培养松茸菌丝体，最终在d 24得到12.77 g/L的生物量，后续的工作需要在合适的生物反应器上寻找最优的补料培养方法。
　　
　　参考文献
　　[1]Kawagishi H，Hamajima K，Takanami R，et al. Growth promotion of mycelia of the matsutake mushroom Tricholoma matsutake by D-isoleucine[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2004, 68(11): 2405-2407
　　[2]伦志明，李玉花，傅禄敏. 松口磨对纤维二糖的利用能力[J]. 菌物学报，2004，23（3）：563-567.
　　[3]陈羽，王凤珍，陈应龙. 两个松茸菌株培养条件的研究[J]. 林业科学研究，2000，13（4）：410-415.
　　[4]曾东方，罗信昌，傅伟杰. 松口蘑菌丝体的分离和RAPD-PCR分析[J]. 微生物学报，2001，41（3）：278-286.
　　[5]傅伟杰，许广波，傅民杰，等. 松口蘑的驯化栽培及人工促繁[J]. 中国食用菌，2004，23（2）：3-6.
　　
　　注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”