食用菌菌种退化原因分析及复壮方法的探讨

春雨菌业

作者：李红，肖千明，刘娜，张敏，张季军，宋莹，刘岩岩　(辽宁省农业科学院蔬菜研究所，辽宁沈阳110161)　辽宁农业科学2010(4)：53～55　　摘要：综述了食用菌菌种发生退化的原因(遗传学、细胞学、生理学、保藏方法和感染病毒)，并提出了复壮、定期重新分离等解决方法，为食用菌菌种保藏、生产提供参考。
　　关键词：菌种退化；复壮；定期分离
　　本文分析了食用菌菌种退化原因和探讨复壮技术，拟从退化的菌种群体中找出尚未退化的个体，保持菌种的优良性状，减少环境因子的影响，达到长期延续菌种的优质、高产和抗逆等优良特性目标。
　　1　菌种退化原因分析
　　1.1　遗传学和细胞学的原因
　　按照遗传学和细胞学的观点，细胞分裂周期越短生长越快的生物，在一定时间内发生变异的几率越高。食用菌的细胞分裂和生长速度比植物和动物都快，因此菌种群体中变异个体存在的几率大大增加。菌丝在生长过程中自身发生自然突变的突变率较高，据测算大约每366个细胞中平均就有一个细胞发生自然突变。所以菌种转管繁殖的后代与亲本菌种不可能完全一样，转管次数越多，变异越大，稍有不慎，选择失误，极易造成整个菌株生产性能下降。随着时间的推移，继代保藏的食用菌品种的一些优良性状会逐渐因负向突变而丧失。
　　1.2　基因突变引起的菌种性能衰退
　　一些食用菌品种(香菇、双孢菇)是四极性异宗结合真菌，极性发生变异导致菌种性能衰退，采用单孢育种和多孢分离选种时，应注意单核菌丝之间的可亲和性配对，问题，目前，国内一些正在衰退的老菌种的单核体有极性丢失的现象，同时香菇双核体的单核化也是菌种退化的一个重要原因。
　　自交产生的变异时有发生。目前人工栽培的品种多，生产上无法隔离，这样很容易发生品种问的杂交，即使在一个出菇场所只栽一个品种，所产生的担孢子还可能和原来的双核菌丝产生杂交。据日本有关文献报道，香菇段木栽培时，这种自体杂交产生杂种子实体的概率为：第二年15％、第三年20％、第四年30％这种自交在不考虑染色体互换引起。
　　杂交种性不稳定，生产上最初的几年表现良好，几年后表现逐渐变差。基因突变在自然情况下就可发生，这种自然突变是由于自然界各种各样的原因所造成的，如受紫外线、射线的照射及化学诱变剂诱变等都可能使基因发生突变。
　　1.3　生理学方面的原因
　　人工栽培的食用菌菌种，大多生长并被保存在一定的半人工合成的琼脂培养基上。在这类培养基上，菌种体虽能进行正常的营养生长，但不能出菇。长期的继代保藏，将导致菌种体固有的繁殖生长因子长期不被启动。
　　培养基质组成和配比不合理，不适宜食用菌的生长发育，导致菌丝生长缓慢、细弱，长期在人工培养条件下不能满足其野性的要求，如培养环境的CO2，浓度过高，培养期间的温度超出其生长极限等，使其失去自我调节能力，失去正常生理功能，导致一些优良性状无法表达。
　　食用菌某些酶活性受到抑制时，子实体形成也受到抑制。菌种体的许多胞外分解酶类，包括纤维素酶、半纤维素酶、多酚氧化酶、过氧化物酶、漆酶等，其活性变化和培养基中的有机底物降解规律是一致的。在鸡腿菇生长中，漆酶的活性变化与木质素的降解速率呈正相关，纤维素酶、半纤维素酶的活性变化与纤维素、半纤维素的降解速率呈正相关。在香菇的研究中得到了类似的结果。黑木耳胞外酶活性的强弱一定程度上决定了菌种对培养料的生物转化率。肖关辉等的试验还发现大多数胞外酶为诱导性质的酶，受不同物质的诱导，而由于半人工合成的基质内天然底物的缺乏而长期不能被诱导产生，减少胞外酶的分泌，抑制胞外酶的活性，进而影响其日后分解天然基质的能力，从而导致菌种的退化。
　　1.4　保藏方法不当引起的品种退化
　　常用菌种一般都采用低温定期移植保藏法，具体操作：将需要保藏的菌种接种在PDA斜面培养基上，适温培养，当菌丝健壮地长满斜面时取出，放在4℃冰箱中保藏，每隔4～6个月时间移植转管1次。生理学方面的原因上面已经讲到，而在保藏过程中光照、温度刺激等也可引起菌种的退化。
　　1.5　菌株无性繁殖体感染病毒
　　某些菌株在长期的使用过程中，组织体或菌丝体感染病毒，病毒颗粒在细胞内与染色体同步复制形成一种平衡状态(感染潜伏)，一旦条件发生变化，平衡打破，细胞内病毒颗粒大量复制骤增，菌丝体内的代谢活动受到严重抑制，分解木质素，纤维素能力下降，出现菌丝生长速度慢，末端细弱，气生菌丝减少，培养料分解不彻底，露出了木屑原色等症状。
　　2　食用菌菌种复壮方法
　　2.1　预防菌种退化的方法
　　2.1.1　淘汰已衰退的个体
　　进行菌种复壮，首先必须对生产上长期使用的菌种进行纯化分离，把已退化菌群中仍保持原菌种典型性状的单个菌体细胞分离出来，经生长测定后进行扩大培养，以恢复原菌种的优良性状。
　　具体操作如下：在无菌条件下，将试管中的菌丝体刮下，放入装有100ml无菌水的三角瓶中，充分摇动振荡，使菌丝分散，然后用注射器吸取10ml菌丝液，注入装有9Oml无菌水的三角瓶内，充分摇匀后，接人培养皿平板培养基上，每个平板接人2～3滴菌丝液，使菌丝液分散在平板上，在适宜温度下培养，使菌丝萌发，从中挑选健壮的菌丝接入斜面试管。等到菌丝长满斜面，经试验证明符合原菌种的性状后，即可用于生产。
　　2.1.2　定期重新分离菌种
　　在生产上使用的菌种，一般1～2年后必须重新分离1次，以起到复壮的作用。通常利用组织分离法进行复壮，这种方法简便易行，且周期短，从生理学的角度来说，菌种体通过生产栽培，然后经选取具典型亲本特征或优于亲本性状的子实体进行组织分离，这本身就是一次利用天然培养料对菌株进行复壮的过程。另外，也可采用孢子分离法，广西大学的莫天砚等利用改良的多孢分离方法，把孢子分离与组织分离技术结合起来，前者使基因得以重组，使新菌株产生生长优势成为可能，后者可使具有优势的混合群体得以纯化，成为
具有遗传稳定性的优势菌株，从而可以有效的防止日后生产过程中出现分离与过快衰退现象。不论采用哪种方法，都应挑选形态等性状与原来菌种性状相同的子实体，新分离的菌种，必须经过试验，性能符合要求后，方能用于生产。
　　2.1.3　代料栽培的木生菌类，要定期接入木材中，待长出子实体后，挑选菇木或耳木进行种木分离，以便起选优作用。
　　2.2　遗传变异引起的菌种种性衰退的检测与预防
　　对于基因变异导致菌丝分解能力下降的，可以采用对生产种定期检测菌丝分解培养料能力及其有关的酶系，提前进行了解、及时淘汰，不让在生产上使用。
　　由双核体单核化引起的菌种种性衰退，则可以通过显微镜对菌丝有无锁状联合的检查，区分确定，以杜绝使用单核化菌丝造成的危害。
　　对于自然杂交引起的变异，通过启用原始保存菌株，也可以通过正确的选择符合原特性的种菇，防止由此引起的种性衰退。
　　对于新杂交种性不稳定的，引种使用前在了解其特性的基础上，先进行出菇品比试验和一定的中试示范试验，证明生产性能优良后再应用于实际生产。
　　2.3　创造菌种生长的良好营养条件和生活环境
　　适宜的菌种培养基，能使菌种生长健壮，减少衰退，营养不足和过于丰富对菌种生长均不利；因为菌种的生长繁殖受物理、化学和生物等外界条件的制约，所以适宜的条件，会使菌种生长良好，衰退减慢；如果条件不适宜，则会加快菌种衰退的速度。
　　2.4　变换传代保藏培养基配方
　　在菌种传代保藏中，经常改变培养基的配方成份，切忌连续使用某一培养基固定配方，这也是防止菌种衰退的一项重要措施。
　　2.5　控制菌种传代次数
　　菌种传代次数越多，产生突变的机率越高，菌种发生衰退的机会就越多。在生产中应严格控制菌种传代次数，一般不能超过5代。
　　2.6　采用适宜的保藏方法
　　尽量避免在半人工合成的琼脂斜面培养基上保藏，可采用液体石蜡保藏法、沙土管保藏法、滤纸片保藏法、自然基质保藏法、生理盐水保藏法、冷冻真空干燥法、液氮超低温保藏法等，这些方法都可以保藏2年以上，减少传代次数。
　　2.7　对于病毒感染的预防
　　由于病毒是通过菌丝融合而传染的，所以禁止在有病毒感染现象的菇场选种菇。同时在继代培养及保藏过程中尽可能做到无菌条件，以防转管切割时创伤多，病毒感染机会也多。对于已感染病毒的菌种应坚决更换。在菌种使用前进行高、低温等较恶劣环境条件下培养观察菌丝生长状况，进行初步检查，对于出售量大的菌种要送有关权威检测机构检验，以防造成生产上的损失。
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