灵芝的液体发酵与菌种制作

春雨菌业

　灵芝液体发酵培养又叫液体深层培养，就是将灵芝菌接种在液体培养基中。给以充足的无菌空气、保持一定的温度使之生长，液体发酵菌丝生长快，完成一个生产周期只要18～23天左右，发酵罐周期只需4～6天。发酵产物有菌丝体和发酵液。发酵液中有大量的灵芝菌丝分泌物，菌丝体和发酵液二者都有药用价值。
　　液体深层发酵培养的过程如下：
　　斜面试管菌种→摇瓶通气培养→种子罐培养→发酵罐培养→发酵产物收集。
　　灵芝液体发酵培养，菌丝生长快，一般在4～5天就可完成一次发酵。液体发酵时由於所用培养原料都为速效养分，又不断搅拌，所以一旦感染杂菌，就会马上大量繁殖，从而造成发酵失败，所以无菌操作要求特别严格（要在无菌状态下）。
　　一、液体深层培养对培养基要求
　　1.液体发酵培养需要速效的配伍培养基、适当的pH、温度和通风条件。
　　2.液体深层发酵培养需要碳源养分、氮源养分和微量元素养分。
　　3.灵芝深层发酵所需要的碳源养分有葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉等其中最好利用的是葡萄糖。
　　4.葡萄糖、麦芽糖、蔗糖是小分子糖，培养基中用量过高时，会使渗透压提高，从而会使菌丝内的水分外渗，造成生理缺水而生长不出或不能生长。
　　5.淀粉是一种大分子的物质，在水溶液不易形成高渗现象，所以用玉米粉或淀粉做碳源养分时，淀粉用量可提高可达到5～6%左右。
　　6.氮源是构成细胞的主要物质，液体发酵通常用的氮源物资有玉米浆、玉米粉、鱼粉、蚕蛹粉、酵粉等。
　　7.灵芝深层培养需要的金属元素，主要是P、K、Mg、Ca、Zn、S等元素的无机盐，其中对P、K、Mg的需要量最多。
　　8.除P元素外，灵芝对这些金属元素的要求只要培养基总量的百万分之几即可。由於需要量甚微，一般天然培养基中所含有的微量元素已足够其生长之用。
　　二、灵芝深层发酵对酸碱度的要求
　　1.灵芝液体深层发酵最适宜的酸碱度为pH4.5～6，过酸过碱对菌丝生长都不利，pH值过低，菌丝粗，菌丝短，生长慢；pH值过高，菌丝细弱，菌丝可用率低。
　　2.灵芝菌丝在生长过程中会产生酸性物质，会使培养基pH下降，当pH降至3.5以下时，菌丝就不会生长。菌丝亦会开始自溶，菌丝自溶后，培养基pH就会上升，所以在发酵时，若测定结果pH有突然明显上升趋势时，就可能是菌丝已开始自溶。
　　3.由於发酵过程中，培养基pH值会发生变化，所以在发酵时每隔一定时间（一般为7～8小时）就要测pH值，当培养基pH值急剧下降，菌丝生长不良时，就要用氨水或碱液调节培养pH。
　　表：pH值对灵芝菌丝生长的影响（参考值）
　　pH值 菌丝 菌丝干重 终点
　　(灭菌后) 密度（%）pH
　　2.8——  0 ——
　　3.6廾0.65——
　　4.2廾0.673.8
　　4.8廾0.763.8
　　5.2卅1.103.9
　　5.6卅1.204.6
　　6.0廾1.184.6
　　6.6廾0.675.4
　　7.2廾0.656.2
　　9.0——  ————
　　三、灵芝深层发酵的温度条件
　　1.灵芝深层发酵的适宜温度为25～30℃。发酵时必须给以最适当的温度条件，高于30℃时菌丝生长快，但菌丝得率低，且容易自溶，发酵液的色泽深，高于36℃时，灵芝菌丝停止生长，40℃以上时，菌丝很快死亡。
　　2.发酵温度会对发酵产物积累发生影响，温度高，菌丝呼吸强度大，营养物质的消耗量多，发酵产物累积少，温度低，菌丝生长慢，营养物质的消耗少，发酵代谢物多，但温度低，发酵周期就会延长，成本就会提高。所以发酵时，前期以菌丝生长为主要阶段，温度可控制在27～28℃左右最佳，以后，当到代谢产物累积阶段时，培养温度应降到20℃左右最佳。
　　四、通气
　　1.深层发酵培养时，菌丝生长快，所以对氧的需要量非常之高，在开始11～18小时内，若发酵液中氧含量不能满足灵芝菌丝生长的需要，将会严重影响菌丝生长。
　　2.但在发酵初期，发酵液中菌丝量少，所以需氧量也可少些，菌丝进入旺盛生长期时，需要的氧量就增加，这时发酵罐通气量应控制到约0.51（v/v min），即每一立方米的发酵液中，每分钟应通入无菌纯净空气约0.51立方米。
　　3.发酵后期，菌丝衰老，代谢能力下降，呼吸量也降低，所以通气量可适当减少。
　　4.通气发酵培养时，要不断的搅拌，搅拌能使氧气均匀的分布在发酵液中，通过搅拌，发酵液中可溶解更多的氧气，菌丝分布也均匀，但搅拌速度不能太快，搅拌速度太快菌丝容易产生损伤。
　　五、接种量和菌龄
　　1、液体深层发酵培养时，菌丝生长速度与接种量有关，接种量多，菌丝生长快，杂菌感染率低，但菌丝老化快，接种量少，菌丝生长慢，菌丝老化也慢，但若在较长时间中，发酵液中没有足够的灵芝菌丝时，抗菌性就会降低，所以接种量过少时，容易感染杂菌。
　　2、发酵用的菌种必须菌龄短、生命力旺盛、生长速度快这样发酵周期短，经济效益高，同时，菌种生命力强，抗杂菌能力也强。菌龄老、生命力弱、生长速度慢也容易感染杂菌。
　　灵芝深层培养的发酵技术
　　1、生产流程
　　摇瓶培养基制备→灭菌→培养基→灭菌→斜面菌种→接种→摇瓶培养→种子槽发酵→发酵槽发酵→放缸→菌丝和发酵液分离→分别烘乾→培养基配制→灭菌→磨粉直接应用或提取→成品
　　2、斜面菌种制备
　　液体发酵用的斜面菌种，必须生命力强，菌龄期要短，接种后能迅速生长，否则就会感染杂菌，斜面菌种以菌龄10～14天，刚长满试管的为宜。
　　斜面菌种培养基
　　斜面菌种培养基配方种类很多不一定局限哪一种。
　　常用的培养基有：
　　a.PDA斜面培养基 马铃薯200～250g、葡萄糖20～25g、琼脂20～25g、水1000ml、自然pH。
　　制法：马铃薯去皮、切成薄片，称取200g，加水1000ml，煮沸15～20分钟左右，到薯片酥而不烂止，取滤汁，加琼脂，继续煮，待琼脂全部溶解，再加葡萄糖20g，搅拌，使之全部溶解，再补充水至1000ml，装入试管，装量为试管高度的1/5～1/4，塞上棉塞，1.05kg蒸气压保持20～25分钟，灭菌，摆成斜面即可。
　　b.PDA综合培养基 马铃薯200～250g、葡萄糖20～50g、硫酸镁0.2g、磷酸二氢钾0.5g、琼脂20～50g、水1000ml、自然pH。
　　制法与PDA培养基同。
　　c.玉米粉葡萄糖培养基 玉米粉20～25g、葡萄糖15～20g、琼脂20～25g、水1000ml、自然pH。
　　制法：玉米粉40克，加水1000ml，煮沸，保持30～35分钟，不断搅拌，然后用密及纱布过滤，取滤液，以下与PDA培养基制法同。然后灭菌制成斜面。
　　3、摇瓶菌培养
　　培养基 玉米粉1%、葡萄糖3%、酵母粉0.5%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.1%、自然PH。
　　制法：玉米粉加些许的水，均匀的搅拌，加热至微沸，保持1hr，取过滤液，再加入其他成分并补充水至1000ml，搅拌，分装於500ml约三角瓶中，每瓶装200ml，用密及的纱布包口，包上不透气纸，灭菌锅1.05kg蒸气压（121℃）30～35分钟灭菌。
　　4、接种方法
　　在无菌箱或接种室中，用接种针挑取试管表面菌种，并将其割碎，接入灭菌的三角瓶培养基中，每管接1瓶，24～28℃摇瓶培养，摇瓶速度每180次/分，培养5～7天，当培养液呈清澈透明状，培养液中充满菌球时，即可终止摇瓶，作菌种发酵灌接种用。
　　摇瓶菌种质量作为优劣的鉴别。
　　摇瓶菌种质量的好坏对发酵有密切关系，优良的摇瓶菌种接种后菌丝生长迅速，不易感染杂菌。
　　优良的摇瓶菌种应该是：
　　①pH.45。
　　②菌球细小、中实、无黑、发酵液稍有粘稠、菌丝分枝密度高、可见芽头和锁状联合、细胞内充满原生质和空泡。
　　③菌丝球湿重应达发酵液重10～18%。
　　④发酵液清澈透明，有灵芝发酵液特有的香味。
　　⑤显微镜检查下无杂菌。
　　5、菌种发酵灌培养
　　培养基 玉米粉2～3%、蔗糖2～3%、葡萄糖1～2%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.1%、酵母粉0.2%、自然pH。
　　每100L菌种发酵灌培养液（基）60～65L。
　　玉米粉处理和摇瓶培养方法相同。
　　培养条件如下：
　　接种量10～15%，搅拌速度220r/分，通气量l:1.05～1.1（v/v/分）。缸压0.4～0.5公斤/平方厘米、温度26～28℃，培养时间72～84hr。菌种发酵灌有一级和二级之分，一级菌种发酵灌60～100L，二级菌种发酵灌500L，二级菌种发酵灌接种量10～14%，发酵条件与一级菌种发酵灌同，培养时间70～72hr。
　　6、菌种发酵质量标准与摇瓶培养相同
　　a.发酵灌培养
　　发酵灌培养，目的是为了获得尽可能多的灵芝菌丝体及代谢产物，培养时间短。发酵灌培养时接种量5～12%，发酵灌体积大，一般应达15KL以上，人的发酵灌可达20～30KL，发酵时间72hr左右。
　　培养基：蔗糖4～5%，玉米粉2～3%，酵母粉0.2%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.075%，豆油适量。灭菌前pH6.5左右。发酵条件与种子培养相同。
　　放灌标准
　　菌丝无明显芽头和锁状联合，菌丝变细，菌丝原生质聚集，少数菌丝已开始自溶，菌丝含量应达培养基重量15～32%，pH3～3.5。
　　b.发酵过程灵芝菌丝形态变化
　　灵芝发酵过程每8～12hr应取少量发酵液观察，最初阶段菌丝细胞内原生质著生较深，以后逐渐变浅，原生质从分布均匀到凝聚，从开始有明显锁状联合到后期菌丝锁状联合不明显，后期部分菌丝出现自溶。
　　c.放灌后发酵液处理
　　发酵液放出灌，离心或板框压滤，将滤液和菌丝分开，分别烘乾，磨粉。菌丝体粉和发酵液可直接制作药品或保健食品，也可再进一步作提取多醣应用。灵芝菌丝体和发酵液可单独也可合并应用。灵芝菌丝体和发酵液萃取多醣方法与子实体萃取多醣方法相同。
　　d、灵芝深层发酵培养中杂菌感染和防治办法
　　灵芝深层发酵培养需要在无菌的条件下著手。因为培养液中营养成分很丰富且在不断搅拌所以一旦感染杂菌整灌菌种即会遭到污染所以一旦感染杂菌应会造成发酵失败因此深层发酵必须做好杂菌防治工作。灵芝深层发酵培养杂菌感染的环节相当之多，包括菌种带杂菌，设备密封或培养基灭菌不彻底，接种操作不谨慎等等。
　　防治杂菌污染必须做好下列工作：
　　①试管菌种一定要纯，接种前要放在灯下仔细检查，不得有疑是任何杂菌现象。
　　②菌种的年龄要短，生命力要强，要有一定接种量，在发酵灌中生长迅速，灵芝菌丝占优势后，杂菌即不感染。
　　③培养基原料要新鲜，不能有霉变，彻底灭菌，培养基中不可有任何杂物。
　　④设备要经常检修、阀门、管道接种口密封严，不能有渗漏情形发生。
　　⑤空气过滤器内不能受潮，发酵通气时过滤器内要始终保持正压状态，否则培养基会因为流到过滤器内，使过滤器内受潮，此时就必须及时更换内芯。
　　⑥接种操作要细心，做好无菌操作。
　　⑦发酵时防止发生泡沫冒顶。
　　⑧随时取样检验，观察发酵液的色泽和透明度、气味发酵结束时发酵液应清澈、透明，有特殊清香味，无霉味、酒味和臭味，若发现杂菌感染应立即放灌，寻找污原因。
　　7、发酵液杂菌检验方法
　　杂菌检查，一是用肉眼观察发酵液色泽，是否有气泡；二是闻气味，有否异味。但最主要的是进行菌检，在无菌培养条件下观察有否杂菌生长。
　　a.肉汤酚红培养基的检验方法
　　培养基：牛肉膏3～4g、蛋白胨10～12g、葡萄糖3～4g、氯化钠5～6g、酚红溶液2～3ml、水1000ml。
　　灭菌条件：1.05kg/平方厘米、30min。
　　pH：7.0～7.5（灭菌前）。
　　杂菌污染鉴别：发酵液接入培养基内，培养24hr，若色泽由红变黄，培养基混浊，则有受感染。酚红1ml，用95浓度乙醇15ml溶解，再加85ml蒸馏水。
　　b.牛肉膏葡萄糖平板培养基检验方法
　　培养基：牛肉膏3～4g、葡萄糖3～4g、蛋白胨10～12g、氯化钠5～6g、琼脂20～25g、蒸馏水1000ml、pH7.2～7.7（灭菌前）。
　　灭菌条件：1.05kg/平方厘米，30min。
　　培养基灭菌后，倒于培养皿中，平置，使培养基成一平面。在无菌条件下，将发酵液接种在平板培养基上，27～30℃培养48hr。
　　若平板上出现无菌丝样菌落，菌落边缘光滑，菌落呈半透明状或腊脂状或粗糙有皱褶，即表示有酵母污染。若菌落呈菌丝状，色泽多样，即为霉菌污染。
　　灵芝发酵液菌丝体含量测定 取发酵液100ml，用40mesh筛子过滤，去滤液，滤取物用水反覆冲洗，再用砂芯漏斗真空过滤，滤取物在60～65℃烘箱中烘乾恒重、称量，计算其干菌丝体的得率，发酵良好，干菌丝体得率应达1.5～1.8%以上。
　　灵芝菌种的退化和复壮
　　1、灵芝菌种经过若干次的接种栽培后，若平时不注意选优，会呈现菌丝稀疏，即是退化现象，而且菌丝丛中出现褐色无菌丝的斑块，前端菌丝参差不齐、灵芝子实体产量低、小、开片迟、畸形等现象。
　　2、退化原因：接种时菌丝受到机械损伤，菌丝老化，自然退化退化后菌丝酶活性下降，或者是受到病毒感染。
　　3、菌种复壮：菌种发生退化后，必须进行复壮。
　　复壮乃是从原来菌种培养的子实体中选取生长势强、产量高的子实体重新进行组织分离，分离得到新的菌种，且菌丝生长迅速，生长整齐，长满菌丝的菌种瓶壁处没有菌斑出现，栽培后产量、质量达到原来菌种指标的，则是菌种已得到复壮。
　　4、菌种所以能够复壮，是因为原来菌种的各部份菌丝的退化不是同步的，而是二级菌丝（丝状菌丝）在变为三级菌丝（子实体组织菌丝）时，其菌丝有一个变化的过程，菌丝细胞内生殖菌丝细胞器多、大、生命力强，所以有可能获得生命力强的菌种。
　　5、菌种复壮时，从子实体上所分离获得的菌种不会全部都是优良的菌种，所以一次分离菌种必须有一定的数量，至少达10个左右，从较多新分离的菌种中，通过栽培比较，才能得到比较好的菌种，有时，需要从几次分离的大量的菌种才能得到一个好的理想的菌种。