液体菌种生产技术及使用方法

春雨菌业

液体菌种的制作及使用方法 随着食用菌生产的发展,食用菌制种方法在传统固体制作的基础上在不断的改进和提高,其中液体菌种的制作便是其中之一。　 　  液体发酵技术是现代生物技术之一，起源于美国。它是指在生化反应器中，模仿自然界将食药用菌在生育过程中所必需的糖类、有机和无机含有氮素的化合物、无机盐等一些微量元素以及其它营养物质溶解在水中作为培养基，灭菌后接入菌种，通入无菌空气并加以搅拌，提供食用菌菌体呼吸代谢所需要的氧气，并控制适宜的外界条件，进行菌丝大量培养繁殖的过程。工业化大规模的发酵培养即为发酵生产，亦称深层培养或沉没培养。液体菌种由于具有生产规模化、控制自动化、生长无菌化、发菌高速化的生产应用优势,为食用菌产业化的发展提供了良好的种源条件,是食用菌产业化发展的必然方向,已被业内人士所看好。液体菌种是用液体培养基培养而成的菌种。近年来，国内外正积极研究液体菌种的培养与利用。与固体菌种相比，它具有菌种生产周期短、菌龄整齐一致、接种方便、接于固体菌料发酵快、适宜于工厂化生产等优点，因而受到了广大栽培者的欢迎。目前我国已能进行深层发酵的食用菌有：香菇、平菇、凤尾菇、美味侧耳、鲍鱼菇、金针菇、黑木耳、猴头、草菇、蜜环菌、茯苓、滑菇和冬虫夏草等。 　　一、液体菌种的培养方法 　　常见的有采用摇床来生产的摇瓶培养法和采用发酵罐来生产的深层培养法。若少量生产，可以用摇瓶培养法。深层培养需要一整套工业发酵设备，如锅炉、空气压缩机、空气净化系统、发酵罐等，故投资大，只适用于工厂化的大规模生产。而摇瓶培养投资少，设备技术简单，适合一般菌种厂生产使用。本节主要介绍摇瓶培养的技术方法。 1、食用菌液体发酵的培养基 根据培养基中组成的不同，可分为天然培养基和合成培养基。天然培养基的组成均为天然有机物。合成培养基则是采用—些已知化学成分的营养物质作培养基。在生产上，还根据工艺将培养基分为孢子培养基、种子培养基及发酵培养基。但无论如何划分，每一种培养基的组成中都离不开碳、氮、无机盐、微量元素、维生素和生长素等。 　1.1、碳、氮比(C/N) 　　碳、氮比指碳源及氮源在培养基中的含量比。构成菌丝细胞的碳、氮比通常是：8~12:1。由于菌丝生长过程中，一般需50%的碳源作为能量供给菌丝呼吸，另50%的碳源组成菌体细胞。因此培养基中理想碳、氮比的理论值为16~24:1。在液体培养中以菌丝增殖为目的的培养，通常碳、氮比以20:1为宜。 　　虽然食用真菌的液体培养一般要求较高的碳与氮比，即C:N＝20:1左右生长较好，但许多菌种也能在较宽的碳、氮比范围内生长。不同的菌种所要求合适的碳、氮比，可通过实验求得。 1.2、无机盐与微量元素 　　许多无机盐及微量元素对菌种的生理过程的影响与其浓度有关。不同的菌种，对无机盐及微量元素要求的最适浓度也不同。 　　1.2.1．磷   磷是细胞中核酸、核蛋白等重要物质的组成部分，又是许多辅酶(或辅基)高能磷酸键的组成部分。磷是食用菌液体发酵不可缺少的物质，常加入磷酸二氢钾以提供磷，加入量大约为0.1%~0.15%。 　　1.2.2．镁   镁在细胞中起着稳定核蛋白、细胞膜和核酸的作用，而且是—些重要酶的活化剂，是食用真菌液体培养中不可缺少的营养成分。一般通过加入硫酸镁以提供镁，浓度通常是0.05%~0.075%。 　　1.2.3．钾、钙、钠   钾不参与细胞结构物质的构成，但控制原生质的胶态和细脑膜的透性。钙离子与细胞透性有关。钠离子能维持细胞渗透压，钠离子可以部分代替钾离子的作用。三种物质需求量甚微，若采用天然培养基，可不必另加。 　　1.2.4．硫、铁   硫是菌体细胞蛋白质的组成部分(胱氨酸、半胱氨酸及蛋氨酸中皆含硫)，铁是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的组成部分，亦是菌体有氧代谢中不可缺少的元素。 　　1.2.5．锌、锰、钴、铜   锌、锰、钴等离子是某些酶的辅基或激活剂。铜是多元酚氧化酶的活性基。在配制培养基时应注意，镁和磷的添加不宜过多，否则会带来危害。菌体对锌、锰、钴、铜等微量元素的需求量甚少，一般天然有机原料中均有，不必另加。碳酸钙本身不溶于水，但可以调节培养其中的酸碱度。磷酸盐与碳酸钙不宜混合灭菌，否则会形成不溶于水的磷酸盐，使可溶性的磷酸盐浓度大大降低。 1.3、维生素　　维生素在细胞中作为辅酶的成分，具有催化功能。大多数食用真菌的培养都与B族维生素有关，维生素B1是目前已知对绝大多数食用真菌生长有利的维生素。其适宜浓度在50~1000μg/L之间。 2、摇瓶振荡培养技术 　　培养液配制好后，装入500mL容量的三角烧瓶中，每瓶装量为100mL，并加入0～15粒小玻璃珠，加棉塞后再包扎牛皮纸封口，在1.5kg/cm2压力下灭菌30分钟，取出冷却到30℃以下时，接入一块约2平方厘米的斜面菌种，于23℃～25℃下静置培养48小时，再置往复式摇床上振荡培养，振荡频率为80～100次/分，振幅6cm～10cm。如果用旋转式摇床，振荡频率为200～220转／分。摇床室温控制在24℃～25℃，培养时间因菌类不同而异，一般是在7天左右。培养结束的标准是：培养液清澈透明，液中悬浮着大量小菌丝球，并伴有各种菇类特有的香味。 　　二、液体菌种的检验方法 　　对液体菌种进行检验可采用感官检查和取样测验相结合的方法。 　　2.1. 感官检查  可采用“看、旋、嗅”的步骤进行检查。 　　看：将样品静置桌上观察。一看菌液颜色和透明度，正常发酵醪液呈黄色或黄褐色，清澈透明，菌丝颜色因菌种而异，老化后颜色变深；染杂菌的醪液则混浊不透明。二看菌丝形态和大小，正常的菌丝大小一致，呈球状、片状、絮状或棒状，菌丝粗壮，线条分明；而染杂菌后，菌丝纤细，轮廓不清。三看上清液与沉淀的比例，菌丝体占比例越大越好，较好的液体菌种，在瓶中所占比例可达80%左右。四看pH值指标是否变色，在培养液中加入甲基红或复合指标剂，经3～5天颜色改变，说明培养液pH值到达4.0左右，为发酵点；如果在24小时内即变色，说明因杂菌快速生长而使培养液酸度剧变。五看有无酵母线，如果在培养液与空气交界处的瓶壁上有灰色条状附着物，说明为酵母菌污染所致，此称为酵母线。 　　旋：手提样品瓶轻轻旋转一下，观其菌丝体的特点。醪液的粘稠度高，说明菌种性能好；稀薄者表明菌球少，不宜使用。菌丝的悬浮力好，放置5分钟不沉淀，表明菌种生长力强；反之，如果菌丝极易沉淀，说明菌丝已老化或死亡。再次观其菌丝状态，大小不一，毛刺明显，表明是供氧不足；如果菌球缩小且光滑，或菌丝纤细并有自溶现象，说明污染了杂菌。 　　嗅：在旋转样品后，打开瓶盖嗅气味。培养好的优质液体菌种，均具有芳香气味；而染杂菌的培养液则散发出酸、甜、霉、臭等各种异味。 　　2.2. 取样测验  可取液体菌种进行称重检查和粘度检查；生长力测定和出菇试验；化学检查，包括测pH值、糖含量和氧含量等；显微检查，包括细胞分裂状态观察、普通染色和特殊染色等。 　　三、液体菌种的使用方法 　　液体菌种可作原种使用，也可作栽培使用。 3.1. 作原种  取一支100ml。兽用注射器，去掉针尖，换一根内径1mm～2mm，长100mm～120mm的不锈钢钢管，制成一个菌种接种器。使用前，洗净接种器并用纱布包好，经高压蒸汽灭菌，冷却后抽取液体菌种即可进行接种。 　　经灭菌待接入菌种的原种瓶，先要在无菌条件下去掉棉塞，并改换无菌薄膜包扎瓶口。接种时，将针管插入瓶口上的薄膜，每瓶接种量为10mL～１5ml，要注意使液体菌种均匀分布在培养基表面，拔出针管后要立即用胶布贴封针孔，竖放在培养室的床架上进行培养。 3.2. 作栽培种或直接进行栽培  液体菌种在作栽培使用时，瓶栽的每瓶接种量为10mL～15mL；熟料袋栽的每袋接种量为，小袋10mL～15mL，大袋的20mL～30mL；开放式床栽的，每平方米接种量为500mL～1000mL，不需要接种针筒，可直接均匀洒在培养料面，或进行穴播。

在无菌的条件下把菌种投放到培养基里。

　　安装通气管后用输氧机给培养基输入氧气。

　　把培养基放置在摇床机上进行振荡培养。

　　食用菌液体菌种具有生产周期短、菌龄整齐一致、接种方便、发酵快、适宜于工厂化生产等优点。食用菌液体菌种的生产方式一般可分为电磁搅拌法、摇瓶机法、简易深层发酵（吹氧）法、发酵罐法。据省农科院食用菌站工作人员介绍，摇瓶机法不仅接种简单，管理方便，而且生产量根据机器的设定而不同，投资2000~3000元即可。

　　配制液体培养基 先把马铃薯煮到熟而不烂时提取上清液，然后配制3%葡萄糖、1%玉米粉、0.05%硫酸镁、0.1%磷酸二氢钾，最后将马铃薯上清液和上述溶液及水混合即可。液体培养基适用于多种食用菌菌种的培养。

　　摇瓶振荡培养 液体培养基配制好后，装入容量为500毫升的三角烧瓶中，每瓶装入100毫升，并加入1～15粒小玻璃珠，瓶口用棉塞、牛皮纸密封，在1.5千克/平方厘米压强下灭菌30分钟。然后投入一块约2平方厘米的斜面菌种，于23℃～25℃下静置培养24小时。待菌丝萌发时再放置在往复式摇床上振荡培养，振荡频率为每分钟80～100次，振幅为6～10厘米。摇床室的温度控制在24℃～25℃，培养时间因菌类不同而异，一般是5天左右。将振荡好的培养基倒入大容器里，经过扩容后，在无菌条件下安装通气管，用输氧机通入适量氧气后培养48小时。培养结束的标准：培养液清澈透明，其中悬浮着大量小菌丝球，并伴有各种菇类特有的香味。培养好的液体菌种应放入培养箱中保存。