灵芝深层发酵菌丝培养过程的质量控制
灵芝所含的化学成分复杂，目前灵芝主要有效成分有多糖类、三萜类化合物、核苷类等。在灵芝发酵全过程中，把菌体形态、菌体浓度以及养分消耗的生化指标作为控制发酵的标准。 一、镜检 （一）灵芝菌丝 在深层培养的早期，灵芝菌丝粗壮，分枝较少，原生质碱性较强，着色深。显微镜观察菌丝壁有明显的锁状联合。 到培养后期，灵芝菌丝变细，有大量分枝，原生质碱性 较弱，着色浅，出现较多空泡，锁状联合不明显，此为菌丝衰老的象征。 （二）灵芝菌丝球 菌丝疏松或紧密地集合在一起，分枝菌丝从中心向外放射生长，菌丝间被培养基所充填，内部菌丝逐渐老化，甚至菌丝细胞自溶；外层菌丝是年轻的。到了发酵后期菌丝球“刺毛”不清，变短。 二、无菌检验 灵芝所含的化学成分复杂，多达上百种，目前灵芝主要有效成分有多糖类、三萜类化合物、核苷类等。在灵芝发酵全过程中，把菌体形态、菌体浓度以及养分消耗的生化指标作为控制发酵的标准。主要检验灵芝发酵过程中的各个阶段是否被杂菌所污染，如发现问题，应及时处理。 （一）肉汤酚红培养基 把灵芝发酵液接种于肉汤酚红培养基内，如果发酵液被细菌污染，由于细菌生长过程中产酸，致使酚红指示剂由红→黄，培养基出现混浊。 （二）平板杂菌检验培养基 灵芝发酵液涂布于平板培养基上，如染霉菌，可从菌落颜色判断，通常霉菌颜色较鲜艳。菌母类的菌落花样较少，一般呈油脂或蜡质状，表面光滑，粗糙或皱褶，边缘整齐、缺刻或带丝状。 三、含量测定 灵芝菌体浓度和代谢产物含量测定是控制发酵的重要参数之一，它的大小和变化速度对菌体的生化反应都有影响，因此量的测定具有重要意义。 （一）灵芝菌丝体含量测定 干重：取不少于100ml灵芝发酵液，水洗至水相澄清。在沙芯漏斗上用已知干重（60℃烘干）的滤纸真空抽滤，然后将菌丝体连同滤纸于60℃鼓风干燥机2小时，迅速称重，精确至0.01g。 http://www.lzbzf315.net/UploadFiles/image/20120504/2012050413140547547.jpg 湿重：取一定体积的发酵液，用离心机分离，转速3500r/min，离心20分钟后，弃去清液，称菌丝重量。如发酵液粘度大，菌丝不易分离时，采用硫酸铵盐析法或冰冻分离菌丝。 （二）乙醇提取物测定 灵芝发酵液中菌丝分离之后，用95%乙醇反复提取菌丝3～4次，每次1小时，合并乙醇提取液，减压回收乙醇，沉淀物在105℃烘干至恒重。测定乙醇提取物干重以g/100ml表示。 （三）灵芝菌丝球数量的测定 取不少于50ml的灵发酵液，按一定比例再带塞量筒中加水稀释，摇匀后取一定量在直径150mm的培养皿中摊匀，培养皿下垫黑白相间方格纸，用方格数计数。 http://www.lzbzf315.net/UploadFiles/image/20120504/20120504132038823882.jpg （四）灵芝菌丝粘度测定 粘度大小可以作为细胞生长或细胞形态的一项标志，也能反映发酵罐中灵芝菌丝分裂过程的情况，通常用表观粘度（Pa·s）表示之。它的大小可改变氧传递的阻力，又可表示相对灵芝菌体浓度。 （五）灵芝粗多糖重量测定 1.灵芝胞外多糖测定 量取离心后的发酵清液250ml，浓缩至50ml。冷却，搅拌下加入3倍量95%乙醇，于冰箱中静置过夜。次日离心，沉淀物（粗多糖）依次用无水乙醇、丙酮洗涤，真空干燥至恒重，称重准确至0.001g。 2.胞内粗多糖侧定 取一定体积灵芝发酵液，离心或过滤分离其中菌丝体，以蒸馏水洗涤3～5次，60℃烘干，研细。称取菌丝体干粉1g，以50ml蒸馏水于沸水浴中抽取3次，每次2小时。离心后合并抽提液，浓缩至原体积的1/5，搅拌下加入3倍95%乙醇，于冰箱中静置过夜，以下操作同胞外粗多糖测定。按下列公式计算： http://www.lzbzf315.net/UploadFiles/image/20120504/20120504132543504350.jpg （七）灵芝三萜含量的测定 1.样品的制备 取烘干的灵芝菌丝粉碾磨0.3g，菌丝：95%=1:50（w/v），置于50ml容量瓶中加水至刻度，在超声波仪中超声破壁2.5小时后，于4000r/min离心10分钟，取上清液备用。 2.样品测定 采用752型分光光度计，标准溶液用齐墩果酸，用甲醇定容；香草醛溶液为5%冰醋酸，通过比色法测定灵芝三萜含量。 灵芝多糖、灵芝三萜是灵芝及灵芝孢子中重要的化学成分。其含量及活性的高低，直接决定灵芝制剂的作用效果。
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