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灵芝深层发酵菌丝培养过程的质量控制

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发表于 2012-5-11 21:37:19 | 显示全部楼层 |阅读模式
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灵芝所含的化学成分复杂,目前灵芝主要有效成分有多糖类、三萜类化合物、核苷类等。在灵芝发酵全过程中,把菌体形态、菌体浓度以及养分消耗的生化指标作为控制发酵的标准。
      一、镜检
      (一)灵芝菌丝
      在深层培养的早期,灵芝菌丝粗壮,分枝较少,原生质碱性较强,着色深。显微镜观察菌丝壁有明显的锁状联合。
      到培养后期,灵芝菌丝变细,有大量分枝,原生质碱性 较弱,着色浅,出现较多空泡,锁状联合不明显,此为菌丝衰老的象征。
      (二)灵芝菌丝球
      菌丝疏松或紧密地集合在一起,分枝菌丝从中心向外放射生长,菌丝间被培养基所充填,内部菌丝逐渐老化,甚至菌丝细胞自溶;外层菌丝是年轻的。到了发酵后期菌丝球“刺毛”不清,变短。
      二、无菌检验
      灵芝所含的化学成分复杂,多达上百种,目前灵芝主要有效成分有多糖类、三萜类化合物、核苷类等。在灵芝发酵全过程中,把菌体形态、菌体浓度以及养分消耗的生化指标作为控制发酵的标准。主要检验灵芝发酵过程中的各个阶段是否被杂菌所污染,如发现问题,应及时处理。
      (一)肉汤酚红培养基
      把灵芝发酵液接种于肉汤酚红培养基内,如果发酵液被细菌污染,由于细菌生长过程中产酸,致使酚红指示剂由红→黄,培养基出现混浊。
      (二)平板杂菌检验培养基
      灵芝发酵液涂布于平板培养基上,如染霉菌,可从菌落颜色判断,通常霉菌颜色较鲜艳。菌母类的菌落花样较少,一般呈油脂或蜡质状,表面光滑,粗糙或皱褶,边缘整齐、缺刻或带丝状。
      三、含量测定
      灵芝菌体浓度和代谢产物含量测定是控制发酵的重要参数之一,它的大小和变化速度对菌体的生化反应都有影响,因此量的测定具有重要意义。
      (一)灵芝菌丝体含量测定
      干重:取不少于100ml灵芝发酵液,水洗至水相澄清。在沙芯漏斗上用已知干重(60℃烘干)的滤纸真空抽滤,然后将菌丝体连同滤纸于60℃鼓风干燥机2小时,迅速称重,精确至0.01g。
            
      湿重:取一定体积的发酵液,用离心机分离,转速3500r/min,离心20分钟后,弃去清液,称菌丝重量。如发酵液粘度大,菌丝不易分离时,采用硫酸铵盐析法或冰冻分离菌丝。
      (二)乙醇提取物测定
      灵芝发酵液中菌丝分离之后,用95%乙醇反复提取菌丝3~4次,每次1小时,合并乙醇提取液,减压回收乙醇,沉淀物在105℃烘干至恒重。测定乙醇提取物干重以g/100ml表示。
      (三)灵芝菌丝球数量的测定
      取不少于50ml的灵发酵液,按一定比例再带塞量筒中加水稀释,摇匀后取一定量在直径150mm的培养皿中摊匀,培养皿下垫黑白相间方格纸,用方格数计数。
              
      (四)灵芝菌丝粘度测定
      粘度大小可以作为细胞生长或细胞形态的一项标志,也能反映发酵罐中灵芝菌丝分裂过程的情况,通常用表观粘度(Pa·s)表示之。它的大小可改变氧传递的阻力,又可表示相对灵芝菌体浓度。
     (五)灵芝粗多糖重量测定
      1.灵芝胞外多糖测定 量取离心后的发酵清液250ml,浓缩至50ml。冷却,搅拌下加入3倍量95%乙醇,于冰箱中静置过夜。次日离心,沉淀物(粗多糖)依次用无水乙醇、丙酮洗涤,真空干燥至恒重,称重准确至0.001g。
      2.胞内粗多糖侧定 取一定体积灵芝发酵液,离心或过滤分离其中菌丝体,以蒸馏水洗涤3~5次,60℃烘干,研细。称取菌丝体干粉1g,以50ml蒸馏水于沸水浴中抽取3次,每次2小时。离心后合并抽提液,浓缩至原体积的1/5,搅拌下加入3倍95%乙醇,于冰箱中静置过夜,以下操作同胞外粗多糖测定。按下列公式计算:
      
      (七)灵芝三萜含量的测定
      1.样品的制备
      取烘干的灵芝菌丝粉碾磨0.3g,菌丝:95%=1:50(w/v),置于50ml容量瓶中加水至刻度,在超声波仪中超声破壁2.5小时后,于4000r/min离心10分钟,取上清液备用。
      2.样品测定
      采用752型分光光度计,标准溶液用齐墩果酸,用甲醇定容;香草醛溶液为5%冰醋酸,通过比色法测定灵芝三萜含量。
      灵芝多糖、灵芝三萜是灵芝及灵芝孢子中重要的化学成分。其含量及活性的高低,直接决定灵芝制剂的作用效果。
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