食用菌种培育

春雨菌业

食用菌母种的制作，大多使用PDA或PSA及其改良培养基，但一些偏远地区或小批量生产时，配方中的原材料由于价格较高（一般是分析纯），且在农村不易购到，耽误生产。现介绍几个简易制作方法。 1、明胶型培养基。明胶，指食用明胶，一般食品化工商店有售，价格较低。食品生产中用作凝固剂或固形剂的明胶，用于母种生产上代替琼脂（洋菜、琼胶）做凝固剂，笔者90年代初即进行试验并用于生产，证明效果不错，但需对所购商品进行凝固性试验，最后确定每1000毫米中的使用量后，需坚持用该种品牌，不可随意更换。一般生产配方为：土豆200克，麦麸30克，白糖20克，明胶50克左右，水1000毫升。 2、原粮型培养基。即谷粒培养基。小麦、玉米、豆类等均可作为母种培养基，且生产效果很好。方法是：玉米、大豆需破碴，使其大小与小麦粒相仿，浸泡至无白心，用开水煮熟后迅速使用冷水冲洗，捞出后随即拌入适量麦麸，然后装入试管。建议用该培养基时改换大型试管一般可使用20×200或25×200规格的试管，既方便操作，又相应加大一次性生产数量，经济上、时间上均合算。 3、土豆型培养基：选择大个头光滑土豆，去皮后切成撅形条，土豆条长12－15厘米，两端分别厚13厘米和0．2厘米，宽度根据试管直径确定，一般为2厘米以下，并尽量使其成半圆形，以使圆边贴近试管壁。装入试管，常规灭菌等操作即可。 4、南瓜条培养基：秋季南瓜成熟后，可直接和来作母种培养基参照土豆型培养基切制南瓜条，制作同上。 5、苹果泥培养基：将成熟的苹果去皮、去核，研碎成果泥，装入试管，常规灭菌。只是需要接种时用一灭菌木条将果泥压为长条型，使之与普通培养基相彷，而后再常规接种。 6、胡萝卜条培养基：可参照土豆培养基进行      食用菌木渣母种及其制作方法，它涉及一种食用菌母种和它的制作工艺。本发明的食用菌木渣母种由下列原料按重量百分比制成：木渣75-90％、麸皮10-23％、白糖0.5-1.5％、石膏或石灰0.5-1.5％。搅拌：将以上所述的食用菌木渣母种的原料加水搅拌均匀；接种：将灭菌后的食用菌木渣母种降温至室温条件下进行接种，将接种的瓶子放在25-28℃的环境中进行培养，25-30天即可。本发明食用菌木渣母种具有配方简单、原料易得、成本低廉、无需专用设备、接种成活率百分之百、菌丝生产周期比现有PDA法提前20-30天、母种保质期长(4-6个月)的优点。食用菌木渣母种的制作方法具有好学易懂、易操作、不受规模大小的限制，特别适合城镇、农村一家一户进行生产的优点。   配方：马铃薯、葡萄糖、琼脂培养基。马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂18～20克，水1000毫升。pH值5.5～6。
该配方适合香菇及多种食用菌分离和培育母种之用。如果作保藏菌种用，在配方中可再添加磷酸二氢钾2克，硫酸镁0.5克，维生素B110毫克。
制法：选择质量好的马铃薯洗净去皮（已发芽的要挖去芽及周围一小块），将其切成薄片，称取200克。放入铝锅中，加入清水1000毫升，加热煮沸，维持30分钟，用四层纱布过滤，取其汁液，然后将琼脂放在水中浸泡后加入马铃薯汁液中，继续加热至全部溶化（加热过程中要用玻璃棒不断搅拌，以防溢出和焦底），最后加入葡萄糖，并且热水补足1000毫升，测定并调节pH值（用5％的稀盐酸或5％的氢氧化钠溶液）到所需范围内。配制好的培养基要趁热分装入试管，装入量约为试管长度的1／5，装管时要注意勿使培基沾附试管口。分装完毕塞上棉塞，棉塞要求松紧适度，塞入长度约为棉塞总长度的2／3左右，使之既有利通气又能防止杂菌侵入。
塞好棉塞后，把试管直放在小铁丝筐中，盖上油纸或牛皮纸，用绳扎好，或用绳子把试管扎成几捆，棉塞部分    灭菌后，待培养基温度下降至60℃时，再撰成斜面，以防冷凝水积聚过多。摆斜面时，先在桌上放一木棒，将试 管逐支斜放，使斜面长度不超过试管总长度的 1／2，冷却凝 固后，即成斜面培养基。
灭菌后的斜面培养基，要进行无菌测定，可从中取出2～3支，放入30℃左右的恒温箱中培养3天，培养后表面如 仍光滑，无杂菌出现，就可供接种。多次制作后，已有把握，可不做无菌测定试验。
高压灭菌操作步骤和注意事项：
（Ⅰ）在灭菌锅内加水至水位标记高度，首次使用需先进行一次试验，水过少易烧干造成事故，水过多棉塞易受潮。
（Ⅱ）放火锅内的材料，不宜太挤，否则会影响蒸汽的流通和灭菌效果。体积大的瓶子，要分层放置或延长灭菌的时间。
（Ⅲ）盖上锅盖，同时均匀拧紧锅盖上的对角螺旋，勿使漏气，关闭气阀。
（Ⅳ）点火、逐渐升温。水沸后，待锅内压力升至0.5 公斤／厘米2时，逐渐开大放气阀，放净锅内冷空气至压力降至"0"，再关闭放气阀。如不放尽冷空气，即使加大至所需压力，而温度达不到应有的程度，也不能达到彻底灭菌的要求。
（V）继续DO％至所需压力时，开始记灭菌时间，调节火力大小，始终维持所需压力至一定时间。
（VI）停火。让压力自然回降至"0"时，打开放气阀。
（Ⅶ）打开锅盖，用木块垫在盖下，让蒸汽渐渐溢出，借余热烘干棉塞。
（Ⅷ）取出已灭菌的材料，并清除剩水，以防锅底锈蚀。
食用菌母种的制作由于受污染及质量问题的困扰，很少有菇农朋友自行制作，较多的是制作原种：现将两种简单易行的母种制作方法介绍给广大菇农朋友。只要严格按照下列步骤操作，即可制出高质量母种。
一、选择菌种
1．试管种的选择
香菇试管种应菌丝洁白，粗壮，整齐，菌苔表面平整，无或有少量水珠，菌龄25-30天；金针菇试管种应菌丝白色，平伏，浓密，无或有少量粉孢子，菌龄22～27天。
2．原种的选择
瓶装香菇原种应菌丝洁白，密集，尖端整齐，绒毛菌丝旺盛，菌龄30～35天；瓶装金针菇原种应菌丝密集，尖端整齐，有或无气生菌丝，无或有少量粉孢子，菌龄25～30天。
二、选择季节和处理场所
为减少杂菌污染的机会，应避开湿润多雨的季节，秋后则较为理想。场所应选择环境洁净、空气清新、地势高燥、远离畜禽栏舍的房舍较为理想。
三、菌种培养
将上述长满菌丝的4支试管种、4瓶原种移至子实体发生较适温度(香菇12～18℃；金针菇8～15℃)和明亮的漫射光下，促进原基、菌蕾和子实体的发生。选取先生成子‘实体的2支试管种和2瓶原种备用。
四、准备培养基
制作试管斜面培养基10支。配方：胡萝卜100克，葡萄糖20克，琼脂20克，水1000克。
制作方法；按配方正确称取各种营养物质，将胡萝卜、去皮、切片，加水为料的5倍，文火煮沸30分钟，用4层纱布过滤取汁。加入其他营养物质，补水至1000毫升。加入团砗的琼脂，文火煮沸，搅拌至溶解。将培养基趁热装入试管，装入量为试管长度的1／5，加棉塞后用牛皮纸包扎，常规灭菌，摆成试管斜面。
五、消毒接种箱
将上述培养基10支、试管种2支或原种2瓶，酒精灯及接种工具放人接种箱，按每立方米空间10毫升甲醛溶液与等量或半量的高锰酸钾熏蒸消毒1小时，或用“雾消灵”，按每立方米3克，点燃熏蒸消毒半小时。
六、接种、培养
1．在无菌条件下，于酒精灯火焰上操作。
打开试管棉塞，用接种刀挑取子实体内少许组织，移接至试管培养基斜面中央，每支试管种接5支试管斜面。经适温(18～20％)培养2～3周，即得到纯菌丝母种。
2．在无菌条件下，于酒精灯火焰上操作。
打开原种牛皮纸，用接种刀挑取子实体内少许组织，移接至试管培养基斜面中央，每瓶原种接5支试管斜面。经适温(18～20％)培养2～3周，即得到纯菌丝母种。
七、出菇试验
这是检验制作的母种达标与否的方法，在菌株用于生产前必须作出菇试验。可采用瓶(袋)栽培的方法，在常规栽培菌种时，同时试栽培20～50瓶(袋)新制菌种作为对照，如出菇期、出菇数量、菇形大小、肉质厚薄、菌柄长短及菌盖颜色等相比较无多大差异，所制母种即可作为生产用种。
菌种是主要的生物资源，也是食用菌生产首要的生产资料。一个优良的菌种被选育出来以后，必须保持其优良性状不变或尽可能地少变慢变，才不至于降低生产性能，能长期在生产中使用。因此，菌种保藏在食用菌生产上具有重要的意义。
一、菌种保藏原理
菌种保藏的方法很多，但原理大同小异。首先要挑选优良纯种。利用微生物的孢子、芽孢及营养体；其次，根据其生理、生化性，人为创造低温、干燥或缺氧等条件，抑制微生物的代谢作用，使其生命活动降低到极低的程度或处于休眠状态，从而延长菌种生命以及使菌种保持原有的性状，防止变异。不管采用哪种保藏方法，在菌种保存过程中要求不死亡、不污染杂菌和不退化。
二、菌种保藏的方法
1、低温定期移植保藏法。将需要保藏的菌种接种在适宜的斜面培养基上，适温培养，当菌丝健壮地长满斜面时取出，放在3-5℃低温干燥处或4℃冰箱、冰柜中保藏，每隔4-6个月时间移植转管一次，具体应根据菌种特性决定。保藏时要注意环境温度不能太高，以防霉菌通过棉塞进入管内。因此，若用棉塞，可用干净的硫酸纸或牛皮纸包扎棉塞，即可减少污染的机会，也可防止培养基干燥。除草菇菌种外，其他食用菌菌种都能采用此法保藏。
2、液体石蜡保藏法。取化学纯液体石蜡（要求不含水分、不霉变）装于三角瓶中加棉塞并包纸，在1公斤/平方厘米压力下灭菌1小时，再放入40℃恒温箱中数天，以蒸发其中水分，至石蜡油完全透明为止。将处理好的石蜡油移接在空白斜面上，28-30℃下培养2-3天，证明无杂菌生长方可使用。然后用无菌操作的方法把液体石蜡注入待保藏的斜面试管中。注入量以高出培养基斜面1-1.5厘米，塞上橡皮塞，用固体石蜡封口，直立于低温干燥处保藏。保藏时间在一年以上，在低温下，保藏时间还可延长。
3、沙土管保藏法。取河沙用水浸泡洗涤数次，过60目筛除去粗粒，再用10%盐酸浸泡2-4小时，除去其中有机物质，再用水冲洗至流水的pH达到中性，烘干备用。同时取贫脊土或菜园土用水浸泡，使呈中性，沉淀后弃去上清液，烘干碾细，用100目筛子过筛，将处理好的沙与土以（2-4）:1混匀，用磁铁吸出其中的铁质，然后分装小试管或安瓿内，每管装量0.5-2克，塞棉塞，用纸包扎灭菌（1.5公斤/平方厘米，1小时），再干热灭菌（160℃，2-3小时）1-2次，进行无菌检验，合格后使用。将已形成孢子的斜面菌种，在无菌条件下注入无菌水3-5毫升，刮菌苔，制成菌悬液，再用无菌吸管吸取菌液滴入砂土管中，以浸透砂土为止。将接种后的沙土管放入盛有干燥剂的真空干燥器内，接上真空泵抽气数小时，至沙土干燥为止。真空干燥操作需在孢子接入后48小时内完成，以免孢子发芽。制备好的沙土管用石蜡封口，在低温下可保藏2-10年。
4、滤纸片保藏法。取白色（收集深色孢子）或黑色（收集白色孢子）滤纸，剪成4×0.8厘米的小纸条，平铺在培养皿中用纸包裹进行灭菌（1公斤/平方厘米，30分钟）。采用钩悬法收集孢子，让孢子落在滤纸条上。将载有孢子的滤纸条放入保藏试管中，再将保藏试管放入干燥器中1-2天，除去滤纸水分，使滤纸水分含量达2%左右，然后低温保藏。
5、自然基质保藏法
⑴麦粒保藏法：取无瘪粒、无杂质的小麦淘洗干净，浸泡12-15小时，加水煮沸15分钟，继续热浸15分钟，使麦粒胀而不破，沥干水分摊开晾晒，使麦粒的含水量在25%左右。将碳酸钙、石膏拌入熟麦粒中（麦粒、碳酸钙、石膏比例为10公斤:133克:33克），拌和均匀后装入试管中，每管约2-3克，然后清洗试管，塞棉塞，灭菌1.5（1.5公斤/平方厘米，2小时），经无菌检查合格后备用，试管基质冷却后接种，适温培养，待菌丝长满基质后用石蜡涂封棉塞，放低温保藏。2年左右转接一次。
⑵麸曲保藏法。取新鲜麸皮，过60目筛除去粗粒。将麸皮和自来水按1:1拌匀，装入小试管，每管约装1/3高度，加棉塞用纸包扎，高压灭菌（1.5公斤/平方厘米，30分钟），经无菌检查合格后备用，将生长在斜面培养基上的健壮菌种，移种至无菌麸曲管中，移种时注意尽管捣匀小试管中的麸皮，呈疏松状态，在适温下培养至菌丝长满麸皮为止，将麸曲小管置干燥器中，在低温或适温下保藏。
6、生理盐水保藏法。取纯氯化钠0.7-0.9克，放入100%毫升蒸馏水中，搅拌均匀分装试管，每管5-10毫升，进行灭菌（1公斤/平方厘米，30分钟），经无菌检查合格后备用，将待保藏的菌种接入马铃薯葡萄糖液体培养基中适温振荡培养5-7天。无菌操作吸取少许培养菌种注入经检验合格的生理盐水试管中，塞上无菌橡皮塞，用石蜡涂封，在室温或低温保藏。
7、冷冻真空干燥法。将已培养、生长丰富的菌体或孢子悬浮于灭菌的血清、卵白、脱脂奶制成菌悬液，将悬液以无菌操作分装于灭菌的玻璃安瓿瓶中，每管约0.3-0.5毫升，然后用耐压橡皮管与冷冻干燥装置连接，安瓿瓶放在冷冻槽中于-30℃至-40℃迅速冷冻，并在冷冻状态下抽空干燥，并在真空状态下熔封安瓿，在-20℃保存，一般可保存十年以上，但成本较高。
8、液氮超低温保藏法。首先将要保藏的菌种制成菌悬液备用；其次，准备安瓿瓶，每瓶加入0.8毫升冷冻保护剂10%（体积比）甘油蒸馏水溶液，塞棉塞灭菌（1公斤/平方厘米，5分钟）。无菌检查后，接入要保藏的菌种，火焰熔封瓶口，检查是否漏气，将封好口的安瓿瓶放在冻结器内，以每分钟下降1℃的速度缓慢降温，使保藏品逐步均匀地冻结，直至-35℃，以后冻结速度就不需控制，安瓿冻结后立即放入液氮罐内，在-150至-196℃保藏，该法只有少数科研院所使用。