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食用菌菌种分级和生产的基本工艺流程

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发表于 2012-3-26 15:48:54 | 显示全部楼层 |阅读模式
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一、菌种分级  食用菌的菌种分为三级,即母种(一级种)、原种(二级种)和栽培种(三级种)。
  1、母种(一级种) 通过孢子或组织分离培养获得,并经鉴定为种性优良,遗传和生理性状相对稳定的在试管斜面上生长和保存的纯菌丝体。也有人称之为试管种。
  2、原种(二级种) 由母种转接到天然基质(培养基)上经培养而成的菌种。这是菌丝体和天然基质的混合体。
  3、栽培种(三级种) 由原种转接在天然基质(培养基)上扩大繁殖而成的菌种。栽培种也是菌丝体和天然基质的混合体。栽培种常作为栽培用菌种,或直接出菇。也有人称之为生产种。
  二、菌种生产的基本工艺流程
  作为栽培用的菌种,国内外均采用固体培养,使用固体菌种。其大致工艺流程为:
  母种→母种扩繁(培养基制备→接种→培养检查→成品)↓
↓←原种成品←(培养检查←冷却接种←灭菌←配料分装)原种制作
栽培种制作(配料分装→灭菌→冷却接种→培养检查) →栽培种成品
  三、母种(一级种)制作
  母种制作的基本工艺流程为母种(由科研单位、大专院校、菌种保藏专门机构引进)一培养基制备一接种一培养检查一成品。
  (一)、常用培养基及配方
  培养基是食用菌菌种生长所需营养的基质。培养基要具备四个条件,第一,要含有所培养的菌株生长所需要的各种营养物质,如糖类、有机氮、矿物质等。第二,所含养分浓度和状态要利于食用菌的吸收和利用。如食用菌母种培养基使用葡萄糖的浓度多在2%左右,过高和过低都不利于菌丝的生长;食用菌对氮素的吸收优先吸收有机氮,因此,原种和栽培种的培养基中应添加有机氮源,如麦麸、米糠等。第三,要有适宜的酸碱度(pH),食用菌多数喜偏酸性,pH5.0~6.5。第四,经过严格灭菌,保持无菌状态。这最后一点是要通过灭菌才能达到的,然而,灭菌的高温能破坏培养基中的许多化学成分,并能降低pH。这一点必须在配制时就考虑到。这就要求从使用的营养型药品试剂上,要尽量选用热稳定性好的种类,配制时,灭菌前的pH要略高于使用时所需的适宜酸碱度。一般高压蒸汽灭菌0.1~0.12兆帕30分钟,培养基的pH下降0.1~0.3。高压灭菌切勿压力过高,时间过长,以利培养基保持良好的营养和适宜的pH。
  目前食用菌母种生产上使用的都是固体培养基,以琼脂(洋菜)为凝固剂,琼脂的用量从10~24克不等,这依琼脂的质量而定,使用时用量要参考产品使用说明书。此外,当制作相同培养基时,高温季节要较常量多用些,以利凝固,低温季节可按常量使用;较酸的培养基也要较pH较高的培养基琼脂用量多些。
  1、通用培养基
  通用培养基有多种配方,几乎通用于各类食用菌,常用的配方如下:
  ①、PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)
  马铃薯(去皮)200克,葡萄糖20克,琼脂10或20克,水1升。
  ②、综合马铃薯培养基
  马铃薯(去皮)200克,葡萄糖20克,磷酸二氢钾2克,硫酸镁0.5克,琼脂10或20克,水1升。
  ③、马铃薯麦麸综合培养基
  马铃薯200克,麦麸100克,葡萄糖20克,磷酸二氢钾2克,硫酸镁0.5克,琼脂10或20克,水1升。
  ④、马铃薯蛋白胨综合培养基
  马铃薯200克,葡萄糖20克,蛋白胨2~3克,磷酸二氢钾2克,硫酸镁0.5克,琼脂10或20克,水1升。
  ⑤、马铃薯酵母粉综合培养基
  马铃薯200克,葡萄糖20克,酵母粉4~6克,磷酸二氢钾2克,硫酸镁0.5克,琼脂10或20克,水1升。
  2、双孢蘑菇培养基
  ①、马铃薯麦芽汁培养基
  马铃薯(去皮)200克,葡萄糖20克,磷酸二氢钾2克,硫酸镁0.5克,麦芽汁100毫升,琼脂10或20克,水900毫升(与麦芽汁总计1升)。
  ②、堆肥浸汁蔗糖培养基
  堆肥(干)50克,蔗糖15克,琼脂10或20克,水1升。
  ③、改良堆肥PDA培养基
  马铃薯(去皮)200克,堆肥100~150克,葡萄糖20克,硫酸钙1克,琼脂10或20克,水1升。
  ④、堆肥浸汁玉米粉培养基
  堆肥(干)150克,玉米粉30克,琼脂10或20克,水l升。
  ⑤、玉米粉葡萄糖培养基
  玉米粉20~30克,葡萄糖20克,蛋白胨O.5克,琼脂20克,水1升。
  ⑥、马铃薯麦芽汁蛋白胨培养基
  马铃薯(去皮)200克,葡萄糖20克,麦芽汁粉12克,蛋白胨3克,琼脂10或20克,水1升。
  3、平菇培养基
  ①、麦麸(米糠)综合培养基
  麦麸(米糠)50克,葡萄糖5~10克,磷酸二氢钾1克,硫酸镁0.2克,琼脂10或20克,水l升。
  ②、葡萄糖棉籽壳浸汁培养基
  葡萄糖20克,棉籽壳100克,磷酸二氢钾2克,硫酸镁0.5克,琼脂10或20克,水1升。
  4、香菇培养基
  ①、麦麸蛋白胨培养基
  麦麸100克,蛋白胨2克,蔗糖或葡萄糖20克,磷酸二氢钾2克,硫酸镁0.5克,琼脂10或20克,水1升。
  ②、菇木汁培养基
  菇木或人造菇木渣200克,麦麸或米糠100克,葡萄糖20克,硫酸铵l克,琼脂10或20克,水1升。
  ②、酵母粉葡萄糖培养基
  葡萄糖20克,酵母粉5克,琼脂10或20毫升,水1升。
  ③、葡萄糖麦芽糖酵母粉培养基
  葡萄糖10克,麦芽糖10克,酵母粉5克,琼脂10或20克,水1升。
  5、木耳培养基
  ①、黄豆粉培养基
  黄豆粉20克,葡萄糖20克,硫酸镁0.1克,过磷酸钙1.5克,琼脂10或20克,水1升。
  ②、木屑浸出汁综合PDA培养基
  马铃薯(去皮)200克,葡萄糖20克,木屑50~1 o()克,磷酸二氢钾2克,硫酸镁0.5克,琼脂10或20克,水l升。
  6、草菇培养基
  ①、稻草汁培养基
  碎稻草200克,葡萄糖20克,硫酸铵3克,琼脂20克,水1升。
  ②、稻草汁综合PDA培养基
  碎稻草200克,马铃薯(去皮)200克,葡萄糖20克,硫酸镁0.5克,磷酸二氢钾2克,琼脂20克,水1升。
  ③、综合PDYA培养基
  马铃薯(去皮)200克,葡萄糖20克,酵母粉5克,磷酸二氢钾2克,硫酸镁l克,琼脂10或20克,水1升。
  (二)、培养基制作
  培养基制作的步骤为:
  材料选择→准确称量→萃取→配制定量→分装→灭菌→斜面摆放。
  1、材料的选择
  组成食用菌母种培养基的材料中,有些材料浓度、成分都相对稳定,如葡萄糖、磷酸二氢钾等,有些天然营养材料就没有那么稳定了,往往由于对这些材料的选择直接影响培养基使用效果,影响食用菌菌丝的生长。如马铃薯、麦麸挑选不好时,制成培养基后,食用菌菌丝就不能很好地生长。因此,要认真选择,根据我们的经验,选材时要注意:①、发芽的马铃薯不能用,因为芽眼处有较大量的龙葵碱,对菌丝生长有毒害作用;②、表皮颜色变绿的马铃薯不能用;③、麦麸、米糠、豆粉、玉米粉等农产品发霉、发过霉,生虫或生过虫的不能使用。总之,要使用新鲜洁净的材料。
  2、准确称量
  各种食用菌菌丝的生长都要求一定的养分浓度,因此,使用配方的各种养分的配比不可随意更改,称取时要准确。
  3、制备原则
  ①、植物性材料先行煮沸萃取 凡植物性材料均先单独煮沸萃取(两种或两种以上时可混合煮沸萃取),煮沸萃取时间为30分钟,煮沸30分钟后,取其上清液或滤液。如麦麸、米糠、木屑、棉籽壳、稻草、堆肥、马铃薯等。
  ②、生物制剂如酵母粉、蛋白胨,需事先用冷水溶化,然后加入。但不需煮沸。
  ③、化学试剂最后加入 凡属化学试剂类营养物质,如葡萄糖、麦芽糖、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁等,均在配制的最后一步加入,并不断搅拌以使其快速溶解,不可与植物性材料一起煮沸。
  ④、以1升为配制单位 各培养基配方所列材料的用量均以最终配制成1升为单位,即每升培养基中的含量。因此,当某种培养基中加入较大量的某种汁液或某种浸提液时,要注意计算培养基的最终容量。当水煮萃取过程中使培养基水量不足时,可中途加水或最后补足水至l升。
  4、制作方法
  食用菌母种用培养基均含有天然植物材料的浸出液,如最常用的马铃薯、麦麸、米糠等的浸出液。这类材料均先用清水煮沸萃取,取其滤液,用滤液再煮琼脂。下面以通用培养基中的马铃薯酵母粉综合培养基为例讲述培养基的制作方法。
  ①、准备材料 选取没有发芽的马铃薯,洗净去皮,称取200克,并将其切成l厘米左右见方的小块。同时准确称量好其他成分:葡萄糖20克,磷酸二氢钾2克,硫酸镁0.5克,琼脂10或20克,酵母粉4~6克(溶于少量水中)。
  ②、煮沸 将切好的马铃薯小块放入1200毫升左右(煮沸过程中会蒸发200~300毫升水,故煮沸萃取之初要多加水200毫升左右)水中,用铝锅煮沸30分钟。煮沸中不要搅动,以免打碎马铃薯而使培养基沉淀物过多。
  ③、过滤 煮沸30分钟后,用2~4层纱布过滤。
  ④、用滤液融化琼脂 琼脂使用前可剪成2厘米左右长的小段,这样融化会快些,如果琼脂不太干净,最好水洗2~3遍去除杂质。如果使用琼脂粉,最好事先溶于少量冷水中。煮琼脂时,要多搅拌,边煮边搅,直至完全融化。煮沸后要文火,以防溢出。
  ⑤、加入全部组分后定容 琼脂完全融化后,将各组分完全加入,并定容至1升,用玻棒搅拌,使其均匀。
  ⑥、调节pH 加入全部组分定容后,用pH试纸测定培养基的pH,若不适,可用柠檬酸或食醋调低,用氢氧化钠、碳酸钠或石灰调高。在我国多数地区,使用自然水制备培养基时,自然pH多在6.2~6.8,不需再格外调节。
  ⑦、分装调好pH后,即开始分装 食用菌母种常用的试管规格是18~20厘米(长)×18~20毫米(口径)。分装试管的装置可用带铁环架和漏斗的分装架(图3—10),也可自行设计和制作分装装置。自行制作的分装装置是一只1升的大烧杯或量杯,杯中插入一支“V”形玻璃管,没有“V”形玻璃管时,可用与容器等高长度的直玻璃管,管的一头插至杯底,另一头接乳胶管,乳胶管处夹一止水阀,下端再接一10厘米左右长的玻璃管。
   使用自制分装装置分装时,将培养基倒人大烧杯或大量杯后,先将吸耳球插入外端最末端的玻管内,将培养基从容器中吸人玻管,直至流人止水阀处。分装时注意玻管末端的水平一定低于培养基的水平面,否则,培养基不能自动流出。
  分装时,要注意流出的培养基不可沾在近试管口的壁上,以防日后生霉。一旦管口内沾有培养基,待凝固后用接种钩取出,并用潮湿洁净的纱布擦拭干净。
  一般将培养基装至试管的1/5~l/4处,尔后加盖棉塞。棉塞要用干净的梳棉制作,不可用脱脂棉,因为脱脂棉在灭菌中极易吸水,日后易滋生霉菌。棉塞要上下粗细均匀,松紧适度,以塞好手提时不掉为宜。棉塞长度以塞入试管内1.5~2.0厘米长,外露1.5厘米左右为宜。然后7或10支捆成一捆,管口一端用牛皮纸包好扎紧。
  ⑧、灭菌试管 分装打捆后,直立放于灭菌锅中灭菌。灭菌是培养基制备的重要步骤。灭菌是否彻底,是培养基制备成功与否的关键。初次使用高压灭菌锅时,要事先认真阅读使用说明,并严格按说明操作。
  使用高压锅时,先加足水,然后将试管竖立于套桶中,加盖拧好,加热,压好放汽阀。当压力表指针升至0.05兆帕时,打开放汽阀,放汽3~5分钟,然后关闭。当压力达到0.10~0.12兆帕时,开始计时,并保持这一压力30分钟。之后,关闭热源,使锅内压力自然下降。当锅内压力降至0后,打开放汽阀放汽。放净汽后,打开盖,即可将试管摆成斜面。
  ⑨、摆放斜面 一般情况下,打开锅后,不宜立即摆放斜面,以免形成过多的冷凝水。高温季节开锅自然降温30~40分钟较好,低温季节则20分钟左右为宜。
  试管斜面的大小以上限距棉塞3厘米左右为宜。斜面摆成后。不宜再行摆动。斜面固定后,抽取20支试管置于28℃培养箱内恒温培养24~48小时,以检查灭菌效果。培养后若培养基上无微生物长出,表明灭菌成功,即可使用。当时不用的试管斜面可保存于清洁干燥处,以后可随时取用。
  制备母种培养基过程中要注意以下几点:
  ①、各环节紧密衔接,特别是分装后,要立即灭菌,不可隔夜。
  ②、灭菌时放汽要充分,否则影响灭菌后果。
  ③、低温季节分装时注意保温,防止培养基凝固。
  (三)、接种
  1、接种室和接种箱的消毒和使用规程
  接种室和接种箱是接种操作的场所,必须保持高度无菌,这需要使用前的消毒处理和日常卫生的保持。常用的消毒方法有药物熏蒸、药液喷雾和紫外灯照射三种。三种并用时,效果最好。
  ①、药物熏蒸消毒 接种室和接种箱都可使用。当用药物熏蒸接种室时,必须使用前一天进行。熏蒸用药物和用量为甲醛7~8毫升+高锰酸钾5克/米3。处理时,先关闭门窗,将称好的高锰酸钾放在大烧杯或盆内,然后屏住呼吸倒入甲醛,立即出室关门。高锰酸钾使甲醛迅速气化。甲醛对人的眼睛和呼吸道有强烈的刺激作用,因此,熏蒸12小时后必须用和甲醛量相等的氨水中和空气中的甲醛,以便接种操作。摆放氨水杯要在接种操作前3~5小时进行。也可使用气雾消毒剂进行空气消毒,使用方法参考产品使用说明书。
  当接种室内使用接种箱进行接种操作时,接种室不需每次接种前都进行熏蒸消毒处理,这种熏蒸只作为定期处理即可,生产旺季一般每周处理一次,其他季节每月处理一次。
  ②、药液喷雾消毒接种操作开始前,用5%石炭酸液或煤酚皂化液(来苏儿)喷雾。这些消毒液除具杀菌作用外,还可降沉空气中的尘埃和杂菌孢子,净化空气,减少接种操作中的污染。
  ③、紫外灯照射消毒 接种操作前,打开紫外灯消毒30分钟,如果使用普通紫外灯,关闭后必须隔40分钟,待臭氧散尽后才可入室工作。如果使用无臭氧紫外灯,关闭后可立即入室操作。紫外灯管使用超过2 500小时后,作用强度明显下降,要适当延长使用时间。有条件的灯管要定期更换,一般每使用4 000小时后更换。
  ④、使用规程
  a、接种室地面不可用笤帚清扫,必须用墩布拖,以防扬尘。
  b、消毒处理前需将要接种的物品及用具搬入。
  c、接种操作完毕后要随手清洁。连续使用时,则清洁后重新消毒处理。
  d、接种室要定期消毒处理,以保证高度无菌状态。
  e、操作人员必须在接种工作开始前先用肥皂洗净手和手腕,在缓冲间更衣,进入接种室后用75%酒精棉球擦拭双手,特别是指尖,同时擦拭操作台面。
  f、接种操作中途不可进出。
  2、接种
  按上述消毒方法和接种室使用规程处理好后,就可接种了。接种方法是:左手平托母种试管和另一支待接种的试管,菌种在外,待接种的在内,右手持接种钩,在火焰上灼烧蘸有酒精的接种钩。在酒精灯火焰上方拔下试管棉塞,夹于右手指间,接种钩冷却后进入母种试管切取绿豆粒大小一块母种,并迅速转接至待接种的试管斜面中央,在火焰上方同时塞好母种和新接种试管的棉塞。这时,一支试管母种接种完毕。如此反复,一支试管母种一般可转接扩繁30~40支。切取菌种时,注意母种斜面上方较干,要去掉干皮,母种块周围的菌丝也较老,最好不要使用。
  3、接种操作注意事项
  ①、酒精灯火焰要高 酒精灯火焰不够高时,火焰周围的无菌范围小,不利于无菌操作,也易造成接种钩灼烧灭菌不彻底,影响接种后的成品率。影响火焰大小的因素一是酒精浓
度,二是灯芯。酒精浓度越高燃烧越好,最好使用95%的工业酒精。灯芯材料太实,塞得又紧时,内吸的酒精少,火力也不旺。所以,灯芯最好用棉花捻制,并拨出一定的长度。
  ②、母种试管表面和管口要灭菌彻底 作为接种物的母种试管表面并未处于无菌环境下保存。因此,接种时要注意试管表面和管口的灭菌。具体方法是:拔下棉塞后,在酒精灯火焰上转动2~3圈,这样可有效地减少菌种造成的污染。
  ③、拔塞、取种、接种及塞棉塞必须在火焰上方或附近 操作母种试管和待接种的试管一旦打开棉塞,就不能离开火焰,因为只有在火焰周围很小范围内才是绝对无菌的。
  ④、接种钩 接种钩要灼烧彻底 接种钩最好用较薄的材料制成,灼烧时烧至红色。并注意接种钩灼烧的长度,灼烧长度以试管长度为度,在火焰上方反复灼烧3~4次即可
  ⑤、接种时掉到地上的棉塞不能使用 接种时棉塞要夹于右手指间,不可放在操作台上。一旦掉到台面上,塞之前要在火焰上过一遍再用。掉到地上的棉塞严禁使用。
  ⑥、接种钩火焰灭菌后要冷却 不经冷却的接种钩会烫死菌种。冷却一般在无菌的待接种的试管上部空间进行,也可在斜面上端冷却。
  ⑦、消毒酒精要清洁 注意定期更换。
  ⑧、操作要到位动作轻盈、敏捷、快速、准确,尽可能地减小声音。
  ⑨、接种操作后的工作及时清理,打开门窗,排除接种时酒精燃烧放出的废气。之后,关好门窗,打开紫外灯进行使用后的消毒,以便以后使用。
  (四)、培养与检查
  将接种后的试管置于恒温箱或培养室培养,培养室要尽量避光。培养期间,有条件的要求培养温度略低于菌丝生长最适温度,这样培养出的母种会更健壮,一般较菌丝生长最适温度低1~2℃。如木耳菌丝生长最适温度26~28℃,而实际生产中常取25℃培养。培养期间还要求空气干燥,以大气相对湿度<75%为最好。在高温高湿的夏季,要特别注意防止高温削弱菌种的生活力和高湿造成污染。  培养期间要经常检查,及时拣出不良个体。培养期间主要检查两方面,一是有无污染,二是菌丝生长是否正常,包括形态、长速、活力、均匀度等。
  (五)、菌种特征及鉴别
  食用菌的不同种、不同品种母种的肉眼可观的特征不同,长速和生长势等都不同。但是,正常的母种似有一些共同的可供观察和鉴别的特征。
  1、优良母种的共同特征
  ①、生长整齐 同一品种、同一来源的母种,扩繁后,不论扩繁量有多大,只要使用的培养基相同,培养条件相同,试管与试管之间,菌丝的生长外观没有明显的差异。生长外观包括长速、色泽、菌落的薄厚及气生菌丝的多寡等。
  ②、长速正常 不同种、不同品种的食用菌,在一定的营养和培养条件下,都有其固有的生长速度。如平菇中蔬10号,在综合PDA培养基上,在25℃下黑暗培养6天长满斜面。如果长速不在这一范围内,表明菌种活力不够,或老化,或退化,不宜再使用。目前笔者从几个多年前中蔬10号使用者手中收集了中蔬10号菌株,长速都已明显减慢,多需8天才能长满斜面。
  ③、形态特征 不同种、不同品种的食用菌,其母种都有各自特有的形态,如菌落形态、气生菌丝的多寡、菌丝的色泽、培养基中色素的有无及色泽、生长边缘特征等。如糙皮侧耳ACCC50249,在26~28℃培养,长满斜面后2~3天气生菌丝就分泌黄色素,而佛罗里达侧耳各菌株均无这种色素分泌,如木耳和金针菇多数品种在长满斜面之前都不会分泌褐色素溶于培养基中,如果扩繁母种中,在生长期间培养基呈棕褐色,或接种块背面呈较深的色泽,就是不正常现象。这样的菌种多不能正常出耳或出菇,即使出耳出菇,产量也很低。
  ④、菌落生长着的边缘外观饱满、整齐、长势旺盛。
  2、菌种退化、老化的培养特征
  不同种的食用菌菌种,退化老化的表现特征不同,但似有一些规律可循,其主要表现有:
  ①、长速减缓 退化老化的菌种,培养期间往往长速变缓,特别是在琼脂培养基上,明显可见。
  ②、长速不一 退化老化的菌种,继代培养时,个体间长速差异明显,不能同时完成培养。
  ③、长相不一 退化老化的菌种,其继代培养物长相不完全相同,往往菌丝不舒展,有的菌落边缘不整齐,有的菌丝干瘪,有的菌丝稀疏,有的气生菌丝变少,有的在气生菌丝的顶端出现黄色素,有的分泌色素到培养基中。
  ④、似非拮抗现象的出现 当在琼脂培养基上进行培养时,在斜面上常出现星星点点的小菌落,这些小菌落之间,不能随菌落的扩展而融为一体,而是两者边缘之间总有谁都不能逾越的距离,但又不呈现典型的拮抗现象。
  3、主要食用菌母种特征
  ①、双孢蘑菇 双孢蘑菇按菌落特征可分为气生型、半气生型、匍匐型三大类型,近十年来推广的品种多为匍匐型和半气生型。这类品种母种的主要特征是:菌丝紧贴培养基斜面表面生长,数日后多出现细细的菌索,菌丝纤细、微黄,气生菌丝很少,在适宜的培养基和环境条件下一般3~4周长满斜面。
  ②、香菇 菌丝均匀,有气生菌丝,但较少而短,也比较稀疏,菌丝白色。老时形成有韧性的菌皮。在综合PDA培养基上。于25℃下黑暗培养,一般两周左右长满斜面。另外,不同品种菌丝的稀密程度也不同,如Cr-04菌丝浓密洁白,24l-4的菌丝就较稀疏,而菌落的色泽就较清淡。
  ③、平菇 称为平菇的通常只是糙皮侧耳、美味侧耳和佛罗里达侧耳这三个生物学上的种。
  糙皮侧耳和美味侧耳。菌丝粗壮、整齐、致密、洁白,培养后期,特别是当温度偏高时,在气生菌丝上出现褐色或黄色色素,即北方俗称的“黄梢”,或时有黄褐色透明的小液滴。在综合PDA培养基上,黑暗恒温25℃培养,6~7天长满斜面。
  ④、鲍鱼菇 菌丝均匀纤细,气生菌丝较少,表面有棒状分生孢子梗和黑色分生孢子团。在综合PDA培养基上生长缓慢,黑暗且在27℃条件下培养,3周左右长满斜面。
  ⑤、金针菇 菌丝细密,有短绒毛状气生菌丝,有的品种还有稀薄分布的粉状物(粉孢子)。黄色品种常在培养后期出现黄褐色色素,使菌丝不再洁白而稍具污黄,同时,培养基中也有褐色素的分泌。浅黄色品种的菌丝则较白,培养后期仍是洁白。白色品种的菌丝纯白色,且气生菌丝更旺盛。在综合PDA培养基上,23~25℃下黑暗恒温培养10~16天长满斜面,黄色和浅黄色品种生长较快,10~12天长满斜面,白色品种生长较慢,要12~16天才能长满。
  ⑥、木耳 菌丝生长均匀致密、洁白,有气生菌丝,但较短而稀疏,菌丝平铺于培养基表面整齐地生长。在培养期间不形成色素。在综合PDA培养基上,黑暗恒温25℃下培养,2周左右长满斜面。
  ⑦、毛木耳 菌丝绒毛状,较木耳稀疏,气生菌丝多于木耳,培养后期气生菌丝易倒伏。在综合PDA培养基上,黑暗恒温25℃下,培养12~14天长满斜面。
  ⑧、灵芝 菌丝纤细、平坦、致密、洁白、均匀,几乎不见气生菌丝,随着菌丝的生长,菌落的扩展,近接种块处的菌丝逐渐老化形成坚韧的菌皮,并随菌皮的老化,色泽逐渐为淡黄色。在综合PDA培养基上,28~30℃黑暗培养,7~10天长满斜面。
  ⑨、阿魏菇(阿魏侧耳) 该种不同品种间差异显著,有的品种,如ACCC50656,菌落致密、微黄,生长缓慢,在综合PDA培养基上要3周左右能长满斜面;有的品种,如ACCC50869、ACCC50914等菌落舒展、洁白,菌丝也较稀疏,生长较快,在综合PDA培养基上2周即可长满斜面。
  ⑩、草菇 草菇菌丝粗壮但稀疏、半透明、灰白色至微黄色,气生菌丝旺盛,培养2~3天渐产生厚垣孢子,厚垣孢子初灰白色,后渐变成褐色至锈红色。在综合PDA培养基上,黑暗恒温32~34℃下培养,3~4天长满斜面。
  (11)、鸡腿菇(毛头鬼伞) 菌丝绒毛状、致密微黄,菌落边缘整齐,气生菌丝旺盛,多数培养后期有褐色素分泌于培养基中。在综合PDA培养基上,黑暗恒温25℃下培养,10天左右长满斜面。不同自然区域的鸡腿菇培养特征不完全相同。
  4、菌种质量的简单检测
  任何一个菌种场生产菌种的同时,不但要进行小规模的栽培,做出菇试验,还要在出菇试验之前进行一些简单的菌种质量的检测,以免盲目投产,造成不必要的经济损失。
  一个优良品种,现使用的菌种是否还保持着优良品种所特有的优良性状,较准确的检测是贯穿于菌丝生长直至出菇的全过程的。因此菌种场应对这一全过程进行检测。菌丝体生长阶段的检测工作主要有:
  ①、建立标准的培养和观察方法一定的结果来自于一定的方法和一定的条件。方法和条件不同,结果就失去了可比性,也就无法鉴别。因此,需要建立标准。这些标准包括:培养基、培养条件(温度、湿度、pH、光照等)、接种物菌龄、菌种的菌龄等。如香菇菌丝体生长阶段质量检测的标准条件应为:综合PDA培养基,pH5.5~6.0,直径90毫米的培养皿,培养基25毫升,接种物菌龄14~15天,培养条件为黑暗恒温25℃。在这种条件下,接种48小时后开始隔日观察、记录长速、长相、形态等。
  ②、连续观察菌种生长过程中,要连续观察。一切不正常的现象只有在生长过程中才能表现出来,而当菌种长满培养基表面后,其不正常现象多数会被菌种的过龄而掩盖。
  ③、均一性检验将母种接种于标准培养基的平板上,并置于标准的环境条件下培养,每批做30~50个重复,进行长相和长速的连续观察记录。均一性好的品种,每个重复之间长相和长速几乎没有肉眼可见的差异。如果长相和长速不一,则表明原始的母种遗传均一性严重不良,不宜作生产用种。
  (六)、常见问题的分析和处理
  母种生产中常出现以下几个方面的问题,要具体情况具体分析,并采取相应的技术措施。
  1、培养基凝固不良
  有时灭菌后培养基凝固不良,甚至不凝固。可以按以下步骤分析:先检查培养基组分称量时,琼脂是否够量,如果够量再看产品质量是否良好。目前使用效果较好的是福建惠安化工厂生产的乘风牌琼脂,每升培养基仅需9~12克。如果琼脂没有问题,再用pH试纸检测一下培养基的酸碱度,看是否过酸,一般pH低于4.8时凝固不良。当需要较酸的培养基时,可以适当增加琼脂的用量。
  2、接种物不萌发
  接种之日后,接种物一直不萌发。分析的程序是:先从母种上查找原因,检查其是否丧失活力。具体方法是:如果原来母种试管内还留有菌丝体,再转接几支试管,培养观察,最好使用和上次不同时制作的培养基。如果还是不长,表明母种已丧失活力。如果第二次接种物成活了,表明第一次培养基有问题。在生产实践中,接种物全部不萌发的情况极少发生,但常有部分不萌发的事情发生,这常发生于不耐低温保藏的某些种或某些品种,如红灵芝的一些品种,紫芝、毛木耳的一些品种,毛木耳与黑木耳杂交种等。
  3、菌种生长过慢或长势不旺
  每种食用菌都有其固定的生长速度,如果在培养期间没有达到预期的长速,就要认真查找原因:培养基是否合适,包括pH是否适宜,马铃薯品质是否良好等;母种使用前的状态是否良好,包括是否保存期过长,培养基是否干缩,菌丝是否老化,品种是否退化等;培养温度是否适宜;棉塞是否过紧;空气中是否有有毒气体等。培养基不适、菌种过老、品种退化、培养温度过高或过低、棉塞过紧、透气不良、接种箱中或培养环境中残毒甲醛过多都会造成菌种生长缓慢,菌丝稀疏纤弱等。
  4、菌种生长不整齐
  这是指来源相同的试管种扩繁后,继代培养物之间长速不一,甚至形态也不完全相同,生长边缘不整齐,有的生长均匀,有的不舒展,有的呈轮纹状菌落,有的呈云彩状生长,有的表面形成雪花状物,有的菌丝倒伏。出现这种情况时,多属品种退化老化。可挑选其中认为长相长势最好的个体再次进行平板检测,如果仍生长不整齐,其继代培养物不宜再作生产用种源。
  5、细菌污染
  细菌污染可肉眼鉴别,细菌外观上不呈丝状,而是肉色、浅黄色、红色等各色黏稠状、圆形或不规则形的菌落,这便是细菌。造成细菌污染的主要原因有:
  ①、灭菌不彻底 由此造成的污染出现比例高,菌落多污白色,不规则,常先沿管壁出现并扩展,而且出现较早,多培养2~3天就出现。
  ②、接种操作带菌 接种操作带菌物主要是接种钩,一是灼烧灭菌不彻底,二是消毒酒精瓶内细菌过多,酒精浓度不够。这种污染常从接种物周围生出细菌,并在斜面的上半部同时出现。
  ③、母种带菌 常先从接种块周围出现,并逐渐蔓延。
  ④、真菌污染 真菌污染常表现为霉粉状的菌落,常呈现绿色、灰绿、褐色、黑色、橘红色、红色、灰褐色等各色菌落。主要有三个原因:
  一是作为接种物的母种试管表面和管口处理不彻底,接种时还带有霉菌孢子。
  二是作为接种物的母种表面的菌丝有轻度霉菌污染。
  三是灭菌时冷凝水曾打湿棉塞,或分装时管口沾有培养基,培养环境大气相对湿度过高,通风不良。
  四、原种(二级种)和栽培种
  栽培种(三级种)的生产
  (一)、原料和用具
  1、原料
  凡可用来栽培食用菌的各种培养料都可以用来生产原种和栽培种,如木屑、麦秸、稻草、棉籽壳、废棉等。在实际生产中,为了提高菌种质量和使用率,常用多种禾谷类种子作原料,常用的有小麦、大麦、燕麦、谷子、玉米、高梁等。以植物秸秆为主料时,需要加入含氮量较高的麦麸、米糠、豆粉和各种饼肥粉等。并常配以一定量的矿物质,以满足菌丝生长的需要,如硫酸镁(石膏)、碳酸钙、石灰、磷酸二氢钾、硫酸镁、过磷酸钙等。当然,不同地区的原料种类不同,不同食用菌适用的原料也不同,配方也就不同。
  ①、选料原则
  不论选用哪种培养料,都要求新鲜、无霉变、洁净、干燥。此外,颗粒大小要适中,不可过粗,也不可过细。过粗常造成菌丝联结困难,菌种不够旺盛;过细则造成
通气不良,菌丝生长受阻。要尽量就地取材,降低成本。
  ②、预处理
  有的原料作原种和栽培种时,需要预处理,如使用粪草制作的双孢蘑菇原种和栽培种,用各种禾谷类种子制作的各种食用菌的原种和栽培种,粪草需事先堆制发酵,各类谷粒需事先浸泡。这些都应及早准备。
  2、用具
  原种和栽培种生产用具分为消耗性材料和工具两大类。消耗性材料主要有菌种瓶(蘑菇瓶、罐头瓶)、聚丙烯折口塑料袋、菌种瓶用的聚丙烯薄膜盖、棉花(作棉塞用)、套颈、牛皮纸、小线、橡皮圈、标签、记号笔、培养基用各种原料(谷粒、棉籽壳、木屑、麦麸、米糠、石膏、石灰、过磷酸钙、磷酸二氢钾、硫酸镁、糖等)。工具有铁锹、钉耙、水桶、喷雾器、秤、塑料箱(筐)、铁丝筐、推拉小车、铁钩、漏斗、打孔棒等。
  (二)、种型
  原种和栽培种的种型是按菌种所使用的培养料划分的。常分为谷粒种、木屑种、草料种、粪草种和木塞种五大种型。
  1、谷粒种
  以小麦、大麦、燕麦、谷子、玉米、高粱等禾谷类作物种子为培养基。特点是利用率高,节约用种量,播种后很快形成发育中心,利于提高单产。谷粒种几乎适于各种食用菌作原种,但不适于作生料或发酵料栽培的平菇的栽培种。除双孢蘑菇、巴西蘑菇等覆土栽培的菇种外,谷粒种不适合作栽培种,因为菌种生长在无菌条件,而出菇均不在无菌环境,出菇期间的高湿易导致谷粒生霉或腐烂。
  2.木屑种
  以阔叶树木屑为主料,配以麦麸、米糠等辅料为培养基,适合于多种木腐菌类的食用菌,如木耳、毛木耳、香菇、灵芝、猴头、蜜环菌、杨树菇(柱状田头菇)等。
  3、草料种
  以作物秸秆、皮壳为主料,适量加入麦麸或米糠等辅料为培养基,适合于多种可用草本植物秸秆皮壳进行代料栽培的种类,如平菇、凤尾菇、鲍鱼菇、盖囊菇、阿魏菇、杨树菇(柱状田头菇)、草菇、猴头、金针菇、鸡腿菇等。
  4、粪草种
  以发酵过的堆肥为原料,且堆肥中有一定量的厩肥。这种粪草培养基适于双孢蘑菇、大肥菇、巴西蘑菇(姬松茸)的栽培种。其特点是菌丝长得透,播种后抵御不良环境能力较强。缺点是用量较大。
  5、木塞种
  以木塞种粒为主料,配以一定量的木屑添充物为培养基,适合作段木栽培香菇、木耳的栽培种,也适合于茯苓、猪苓、蜜环菌等。
  (三)、常用配方
  前文曾详细讨论过食用菌的不同营养类型,由于它们对营养的要求不同,所以,原种和栽培种的培养基配方也不同。为了方便使用,除木生腐生菌类给予一些通用的培养基配方外,本书将按食用菌种类给出一些较适宜的配方。
  1、木屑种通用培养基配方
  阔叶树木屑78千克,麦麸或米糠20千克,糖1千克,石膏1千克,水适量。适用于香菇、木耳、灵芝、猴头、蜜环菌、银耳、毛木耳、灰树花、金针菇、滑菇、鲍鱼菇、盖囊菇、榆黄蘑、平菇、凤尾菇等。
  2.双孢蘑菇
  ①、谷粒培养基 谷粒(小麦、大麦、燕麦、谷子、高粱均可)100千克,石膏2千克,石灰0.3~0.5千克,水适量。
  ②、粪草培养基 干稻草450千克,干牛粪450千克,花生饼或豆饼17千克,硫酸铵5千克,尿素5千克,过磷酸钙40~50千克,石灰10千克,石膏10千克,水适量。
  稻草事先铡成2~3厘米长的小段,牛粪预湿,然后按配方混合,加水搅拌均匀后,上堆发酵16~25天,发酵期间翻堆4~5次(具体方法参考双孢蘑菇培养料的堆制发酵方法),当稻草柔软呈咖啡色时,抖掉粪块,当时使用,也可晾干后备千克,石膏2千克,石灰1千克,水适量。
  3、草菇
  ①、棉籽壳98千克,石灰2千克,水适量。
  ②、废棉98千克,石灰2千克,水适量。
  ③、稻草(碎)100千克,麦麸20千克,硫酸铵0.2千克,尿素0.2千克,石膏1千克,石灰2千克,水适量。
  ④、稻草(碎)50千克,棉籽壳50千克,石膏1千克,石灰2千克,水适量。
  ⑤、废棉100千克,稻草粉12~25千克,麦麸或米糠25千克,过磷酸钙2.5千克,石膏2.5千克,水适量。
  ⑥、甘蔗渣100千克,麦麸20千克,石灰2.5~3千克,水适量。
  4、灵芝
  ①、阔叶树木屑76千克,麦麸22千克,糖1千克,石膏1千克,水适量。
  ②、棉籽壳45千克,阔叶树木屑45千克,麦麸10千克,石膏1千克,尿素0.1千克,水适量。
  ③、棉籽壳89千克,麦麸或米糠10千克,石膏1千克,水适量。
  5、鲍鱼菇和盖囊菇
  ①、阔叶树木屑78千克,麦麸20千克,糖1千克,石膏1千克,过磷酸钙0.5千克,水适量。
  ②、阔叶树木屑68千克,棉籽壳10千克,麦麸20千克,糖1千克,石膏l千克,过磷酸钙0.5千克,水适量。
  ③、阔叶树木屑74千克,麦麸24千克,糖1千克,石膏1千克,水适量。
  ④、棉籽壳83千克,麦麸或米糠15千克,糖1千克,石膏1千克,过磷酸钙0.5千克,水适量。
  6、阿魏侧耳
  ①、阔叶树木屑78千克,麦麸或米糠20千克,糖1千克,石膏1千克,过磷酸钙0.3千克,水适量。
  ②、棉籽壳88千克,麦麸或米糠10千克,糖1千克,石膏1千克,水适量。
  ③、阔叶树木屑40千克,棉籽壳38千克,麦麸或米糠10千克,糖1千克,石膏l千克,水适量。
  7、鸡腿菇
  ①、棉籽壳90千克,麦麸7千克,糖1千克,石膏1千克,石灰l千克,水适量。
  ②、棉籽壳70千克,麦秸(碎或粉)20千克,麦麸7千克,糖1千克,石膏l千克,石灰1千克,水适量。
  ③、稻草(碎或粉)60千克,麦麸25千克,玉米粉8千克,复合肥5千克,糖1千克,石灰l千克,石膏1千克,水适量。
  ④、阔叶树木屑75千克,麦麸15千克,玉米粉8千克,糖1千克,石膏l千克,水适量。
  ⑤、阔叶树木屑60千克,双孢蘑菇堆肥28千克,麦麸12千克,水适量。
  (四)、生产工艺及技术要求
  原种和栽培种生产工艺及技术要求都是相同的,只是培养基材料不同灭菌要求不同。谷粒种、木屑种、草料种、粪草种和木塞种这五个种型中,比较而言,木屑种和草料种灭菌需时较短,木塞种需时中等,而谷粒种和粪草种都需时较长,且常压蒸汽灭菌很难达到彻底灭菌的效果。因此,必须采用高压蒸汽灭菌。原种和栽培种的生产工艺流程为:
  配料→分装→灭菌→冷却→接种→培养及检查→成品→包装入库。
  1、配料
  ①、谷粒种选择 洁净干燥的谷粒,可用小麦、大麦、燕麦、高粱、玉米、谷子等,筛选干净后,在清水中浸泡8~12小时。浸泡时间依季节温度而定,低温季节要时间长些,高温季节时间短些。浸泡时间切勿过长,以防出芽。再在沸水中煮15分钟左右,以籽粒充分吸水又不胀破为度。然后将谷粒捞出,滤去多余水分后,散铺在可滤水的器具内,如筛子、苇席,略晾干,以表面不见水膜为度。最后拌人石膏、石灰等,并搅拌均匀。
  ②、木屑种选择 洁净均匀的阔叶树木屑和辅料,木屑要过筛,去除尖锐的小木渣,这对袋装菌种特别重要。按配方称取后,混合均匀,然后加水搅拌,直至适宜的含水量,一般含水量在55%~65%,依季节不同和品种的不同含水量不完全相同。一般而言,高温、高湿季节,含水量要偏低些。
  ③、草料种选择 新鲜洁净无霉变的原材料,按配方称取后,混合均匀,然后加水搅拌至适宜的含水量,搅拌时要注意不可有“夹生料”。
  ④、粪草种 按配方称取原材料,边浇水边搅拌,使其均匀,含水量达到70%~75%,然后建堆发酵,发酵期16~20天,发酵期内翻堆4次,具体发酵方法和技术要求参考栽培技术一章中双孢蘑菇的培养料发酵部分。发酵完成后,培养料柔软、疏松、有弹性,有发酵香味,呈咖啡色。 
  ⑤、木塞种 将种粒用l%糖水或营养液(每100升水中含糖1千克,石膏粉1.5千克,过磷酸钙1千克,尿素0.5千克)浸泡12小时(一夜),然后捞出待用。种粒可专门购买,也可自制,自制种粒有两类:用皮带冲冲出的规则种粒和用剪枝刀剪出的枝条种。用皮带冲自制的具体方法是:先将种木锯成1.5厘米左右厚的木片,然后再用皮带冲冲出桶形木块。 
  木屑添充物的配方常用的是:阔叶树木屑78千克,麦麸或米糠20千克,糖1千克,石膏1千克,加水至含水量55%~60%。将培养料和水搅拌均匀后备用。
  种粒与木屑添充物的比例(干重)是100:30,即每100千克干重的种粒,配以30千克干重的木屑添充物。先将种粒与2/3的木屑添充物混合,余下的1/3留作表面的覆盖。
  任何种型的培养基,在配制后都要测试pH,如果发现pH不适,要及时调整。多数食用菌的原种和栽培种的培养基灭菌之前应在pH 6~7.0之间。多数地区的自然水拌料后都在这一范围。加有1%或超过1%石灰的配方,pH会超过7.5,灭菌后会有较大的下降。
2、分装
  分装是将配制好的培养基分别装到特定的原种或栽培种使用的容器中,如菌种瓶、菌种袋。不论是装瓶还是装袋,都要求装得松紧适度,培养基上端距瓶(袋)口要有3厘米左右的距离,瓶(袋)口干净。
  ①、不同种型的分装
  a、谷粒种。以谷粒作培养基时,谷粒装入瓶后,稍加摇动即可。谷粒不可装得过满,上端以距瓶口4厘米为佳,这样能更有效地减少培养期的污染。
  b、木屑种、草料种和粪草种。这些种型的培养基分装时,要用力压实些,瓶的下部可稍松些。木屑、玉米芯粉、稻草粉、豆秸粉等,从外观上能看到颗粒间稍有微小缝隙为度,颗粒较大的碎稻草、碎麦秸,则要用力反复施压,以利日后菌丝的联结。压实后,在瓶(袋)中央从上至下打一洞(到底),以增加培养基中的氧气,利于菌丝生长。 ③木塞种。先装入木塞和木屑添充物的混合物,边装边摇,使其尽量装实,然后在表面加盖木屑添充物1厘米厚左右,并压平。
  ②、不同容器的分装 常用的原种和栽培种的容器有菌种瓶、废罐头瓶和聚丙烯折口塑料袋。生产者可以根据自己的经验和实际情况选择使用。
  a、菌种瓶 菌种瓶也称蘑菇瓶,这是食用菌菌种生产用的专业容器,最适合食用菌菌丝的生长,最适于菌种的生产。其特点是口径大小适宜,利于通气,又不易污染。菌种瓶用无色透明玻璃制作,耐高温高压,容量’750毫升,口径3厘米左右。分装时,以使用漏斗效率最高,瓶口也干净,有利于减少污染。培养基不可装得过多,应装至瓶肩以下(图3—14),若是谷粒种最好要低于瓶肩2厘米。这样,可减少培养期的污染。
  b、废罐头瓶 废罐头瓶来源广泛,物美价廉,购买方便。其优点是分装快,透气性好,发菌快;缺点是扎口慢,污染率偏高。使用罐头瓶时,要用聚丙烯塑料薄膜双层封口,料装至瓶肩处即可。封口时注意切勿漏扎。
  c、聚丙烯折口袋 折口袋比普通袋更易于码放,但折口袋的折角易于被摩擦而出现沙眼。因此,使用折口袋要格外注意折角处。生产原种的塑料袋不可过大,一般以15~17厘米宽,25~30厘米长,0.04~0.05毫米厚为宜,而且要使用套环和棉塞或套盖,以利通气(图3—15)。分装时,先将培养基装入,压平,然后套入套颈,打孑L,加塞或盖。为了节省工时,可购入能多次使用成套的套环和套盖(福建古田盛达食用菌经营部)。原种每袋重400~500克为宜。栽培种则可大一些,可使用17~18厘米宽,33~35厘米长的大袋。使用塑料袋作容器时,要注意配料和分装时去掉较尖锐的粗大颗粒物,如小木渣,以防扎破袋子。 无论使用哪种容器,装好料后,都要从中央打一孑L直至瓶(袋)底,以利菌丝生长。
  3、灭菌
  分装完毕后,要马上灭菌,不可隔夜,特别是在高温高湿季节,拌料和上锅最好在8小时内完成。这一时间间隔越短,灭菌效果越好。中丰富的养分和适宜的含水量,致使大量灭菌效果和日后菌种的生长。
  不论使用高压锅灭菌还是自制常压锅灶灭菌,灭菌物品的排放都不可过于拥挤叠压,以免蒸汽穿透不均匀,灭菌不彻底。当使用较大的灭菌设备时,要使用铁筐或搁板,以利蒸汽
均匀流通,使灭菌物品受热均匀。
  当低温季节使用玻璃瓶作容器时,切勿凉瓶进热锅,以防菌瓶炸裂。
  ①、高压蒸汽灭菌使用压力容器,首先要认真阅读使用说明,并严格按说明操作。高压灭菌的操作步骤应为:
  A、装入灭菌物品,注意棉塞不可朝向锅壁,瓶子最好倒放,棉塞朝向锅门。棉塞朝上时,最好上盖一层牛皮纸,以防棉塞打湿。关闭锅门,拧紧螺杆。
  B、将压力控制器的旋钮拧至套层,先将套层加热上压,当压力达到0.05兆帕时,打开排汽阀放汽。
  C、当套层压力达到预置压力0.12兆帕,或0.14兆帕,或0.20兆帕时,将压力控制器的旋钮拧至消毒,使套层的蒸汽进入消毒室。从此开始计时。不同培养基材料,不同容量,灭菌时间不同。
  谷粒:一次灭菌200瓶以下时,0.14兆帕需3~4小时,300~500瓶需4~5小时,500~800瓶需6~7小时。0.20兆帕200瓶以下需2.5~3.0小时,300~500瓶需4小时,500~800瓶需5小时。
  木屑和草料:0.12兆帕200瓶以下时需1.5小时,300~500瓶需2.5小时。0.14兆帕200瓶以下需l小时,300~500瓶需2小时,500~800瓶需3小时,800瓶以上需4小时。
  粪草:0.12兆帕200瓶以下需4小时,300~500瓶需5~3-3.5小时;500瓶以上最好使用0.14兆帕以上的压力;500-800瓶时,0.14兆帕需4~4.5小时,0.20兆帕需3小时。 
  灭菌过程中如果出现压力和温度不符(指示温度过低),表明锅内冷凝水排出不畅,应拧大冷凝水排出阀。
  D、关闭热源或停止送汽。使压力和温度自然下降。灭菌完毕后切不可人工排汽降压,否则会造成瓶和袋的破裂。当压力降至0后,打开排汽阀,放净饱和蒸汽,放汽时要先慢排,后快排,最后再微开锅盖,让余热把棉塞吸附的水汽蒸发。
  E、打开锅盖,取出灭菌物品,搬入预先消毒处理过的洁净的冷却室。
  ②、常压蒸汽灭菌 一般说来,常压蒸汽灭菌不适合灭菌需时较长的培养基,如谷粒和粪草。常压蒸汽灭菌常用来灭菌木屑种型和草料种型的培养基。容积大小不同,灭菌要求的时间也有不同,一般在8~15小时。常压蒸汽灭菌的操作步骤如下:
  A、加水至足量。
  B、将灭菌物品按层次码放,注意棉塞不可朝向四壁。灭菌物品也不可紧贴四壁,以利蒸汽流动。同时,在灭菌灶下部插好温度计。
  C、关闭灶门,点火加温。为了缩短拌料与灭菌的时间,也可在码放灭菌物品前点火加温。火力要足,关闭灶门后,要在2小时内达到“圆汽”。“圆汽”即达到100℃。
  D、“圆汽”,达到100℃后开始计时,600瓶以下的小锅,要维持100℃8小时,600 ~ 1 000瓶要维持100℃10--12小时。在此期间一是要注意经常观察温度,不可低于98℃,密闭性
能较好的锅灶可达到102~107℃;二是要注意不要烧干锅,没有预热水锅的要随时观察水位,有预热水锅的要经常观察预热水锅的水量,并及时加水。
  E、达到灭菌时间后停止加热,让温度自然下降至锅顶不再有蒸汽上升,然后微开灶门,利用余热蒸发棉塞表面的水分,1~2个小时后打开灶门,取出灭菌物品搬人事先消毒处理过的洁净的冷却室。有条件的可再闷一夜,灭菌效果更好。
  使用常压蒸汽灭菌锅灶要特别注意以下三点:
  水量要足,以产生足够量的蒸汽。
  灶体不可过于严密,以利锅内冷气的排出,蒸汽的流通,但也不可严重漏气,以利保温。
  火力要足,以使蒸汽充足,能较快穿透灭菌物品。火力不足时,虽然锅里的水处于1 00℃,但产生的蒸汽量不够,培养基升温很快,按预定时间达不到预期的灭菌效果。火力要充足到锅顶蒸汽打旋,即“圆汽”。
  4、冷却
  规范化的专业菌种场,冷却室是高度无菌的。因此,从高压灭菌锅的出口取出的物品就直接置于了冷却室冷却,冷却室使用前需经洁净和消毒处理,操作人员进入冷却室要更衣、戴帽、换鞋。置于地面冷却时,要铺无菌布垫,以保持菌种瓶(袋)和铁筐表面高度无菌。
  简易菌种场的冷却室也要尽量清洁无尘,并做好消毒处理。灭菌物品出锅时和搬运过程中尽量少接触非无菌物品。
  冷却室的洁净程度和无菌程度对接种操作过程中的菌种污染起着重大作用。因此,在强化接种操作的无菌意识的同时,要切实做好冷却室的洁净和消毒处理。
  5、接种
  冷却至30℃左右应及时接种。因为在灭菌后与接种前之间的时间越长,菌种瓶(袋)表面被污染或沉落有灰尘的机率越高,造成接种操作的污染的可能性就越大。
  接种的规范过程应是:清洁接种室一搬入接种物和被接种物一消毒一接种操作一搬出接种好的物品一接种室的清理、清洁和消毒。具体方法参考本章母种制作中的接种部分,这里仅具体介绍接种操作。
  接种原种和栽培种的要求与母种接种相同。一支试管母种可以接原种4~5瓶,一瓶原种(750毫升)可以接栽培种40~60瓶。
  原种和栽培种的接种,可二人操作,也可一人完成。当二人操作时,左边的人持待接种的原种瓶或栽培种瓶,负责开盖和盖盖;右边的人持试管母种或原种瓶和接种钩或接种勺(或大镊子)负责接种。一人接种时,可将试管母种或原种瓶置于固定架上,固定架的高度以试管口或原种瓶口正处于酒精灯火焰上方为准。左手移动被接种的原种瓶和栽培种瓶,并开盖、盖盖,右手持接种钩或接种勺取种接种。接种操作的全过程都在酒精火焰上方进行。需特别提起注意的是:
  ①、接种前要仔细检查 作为接种物的母种或原种是否状态良好。这主要从以下几个方面检查:一是菌龄,菌龄适宜的母种或原种,接种成原种或栽培种后,菌丝萌发快,生长快,长势旺,不易污染;二是菌种是否是纯培养,无污染。如果使用污染了的菌种转接,原种和栽培种则全部污染。检查试管母种是否有污染时,一要看菌落表面有无异色异物,二要对着光源看培养基底部和边缘有无明显的斑点,三要看棉塞有无霉菌。检查原种有无污染时,要整个种瓶全方位仔细观察,有杂菌污染过的原种总是出现异色,除明显的霉菌菌落外,多为黄色的拮抗线、拈抗斑。有任何疑虑的母种和原种都不可使用。      
  ②、接种物表面 接种开始前要用酒精棉球擦拭,以除尘和消毒。
  ③、原种表面的老菌丝或菌膜及母种接种块要去除。
  ④、银耳母种每支试管只能接种原种1~2瓶,必须使用有耳基的部位,因为没有耳基部位银耳菌丝太少,香灰菌丝太多;银耳原种只能使用上层部分,因为越往下部银耳菌丝就越少,接种后出耳率低,影响产量。
  ⑤、母种转接原种时,应将母种块置于瓶中的洞口处,以利生长。
  6、培养与检查
  培养室使用前要认真做好清洁和消毒工作,清洁时要注意不要扬尘,有条件的菌种场要定期清洁和消毒。培养期间主要要做好两项工作,一是环境条件的调控,二是对菌种生长情况的检查,及时拣出劣杂个体。
  ①、环境条件的调控
  不同种和品种的食用菌,菌丝体生长的适宜条件不同,这主要是温度、湿度、光线和通风。在实际生产中,要尽量使这些条件调整到最适,以满足食用菌生长的需要。
  A、温度
  食用菌耐高温性能较差,此外,高温还有利于霉菌的生长。所以,培养温度切勿过高,以培养物菌丝生长的最适温度或稍低于最适温度为宜。应注意瓶(袋)内培养基的温度较外部一般高2~3℃,培养室温度应控制在低于菌丝生长最适温度2~3℃。
  培养过程中,随着菌种的生长,生物量增加,发酵热会日渐增加,高温季节要格外注意降温,低温季节要逐渐减少加温。
  培养室的加温方法很多,如暖气加温、煤火加温、电热加温等,生产者可根据自己的经济和生产情况,选择适宜的加温方式。这里需要提醒生产者的是,采用煤火加温时,要安装烟囱或将炉灶放在培养室外,通过火墙加温,以避免一氧化碳对菌种生长的不良影响。
  培养室的降温可采用空调降温、遮阳降温、通风降温、喷水降温等。采用空调降温时,风量不可过大,要求培养室的空气洁净度高,否则,易由空气尘埃的流动导致污染。采用遮阳降温时,可将培养室的屋顶搭架遮阳物,还可在朝阳面架起遮阳屏,也可在窗外挂草帘。喷水降温时要注意通风,以防霉菌滋生。
  简易菌种场在高温季节可采用“近地稀养”的方法培养菌种,所谓“近地稀养”,就是将菌种置于地面和距地面较近的培养架上,菌种稀疏摆放,瓶(袋)间留有1~2厘米的空隙,以利散热。据测定,地面温度较地面以上1.5米高处温度低2~3℃。山区可在高海拔处制种,也可达到降温培养的效果。
  B、大气相对湿度
同 培养室大气相对湿度最好控制在75%以下。有条件采取空调降温的培养室,降温的同时即可除湿,没有空调降温条件的,高湿季节要格外注意除湿。目前以通风和石灰吸附两大除湿方法为主。利用石灰吸附除湿时,要在培养前洒好石灰,以减少培养期菌种的搬动和培养室空气中的粉尘污染。石灰可撒于地面和培养架上。石灰一方面可以吸附空气中的水分,同时还是很好的消毒剂,利于菌种的无菌培养。低温高湿的梅雨季节,可采取加温排湿。
  C、光线
  食用菌菌丝生长不需要光,极个别品种仅需微弱的散射光。因此,培养室要尽量避光。特别是在培养后期,上部菌丝比较成熟,遇光后易形成原基。 ④通风换气。食用菌是好气性真菌,菌丝生长需要充足的氧气。另外,菌丝在生长中,呼吸放出大量的二氧化碳和水。多数食用菌菌丝生长对二氧化碳不敏感,较高浓度的二氧化碳反而能促进菌丝的生长。因此,培养室的通风作用主要是增加氧气、排湿和调节温度。
  ②、检查
  原种和栽培种在培养期间,要经常检查,以及时淘汰劣质菌种体和污染的个体。一般而言,原种接种后4~7天内行第一次检查,表面长满之前行第二次检查,菌种长至瓶肩下至瓶的l/2深度时行第三次检查,当多数菌种长至将近满时行第四次检查。经过这四次检查后一切都正常的原种才成为成品,方可包装人库。栽培种应在接种后长至料深I厘米左右行第一次检查,长至l/2~l/3深度行第二次检查,长满之前行第三次检查。检查主要是以下内容:
  A、萌发是否正常 原种在进行第一次检查时进行。发现萌发缓慢或菌丝细弱者,及时拣出。要逐瓶(袋)检查,不可遗漏。
  B、有无污染 在各次检查中,有无污染都需仔细检查,特别是原种尚未长满表面之前,要仔细观察,看是否有其他菌落的生长。有时,分解木质纤维素能力不强的杂菌侵染后,仅在培养基表面形成小小的菌落,经数日培养后,常被食用菌菌丝所盖没。在这种情况下,菌种长满后很难分辨。对于这类污染菌,早期的检查和发现格外重要。
  C、活力和生长势 这贯穿于各次检查,菌种的活力和生长势主要表现在菌丝的粗细、浓密程度、洁白度、整齐度等。要及时拣出菌丝细弱、稀疏、苍白无力、边缘生长带不健壮、不整齐的个体。
  在培养基适宜、灭菌彻底、培养环境条件合适的情况下,多数食用菌,如平菇、香菇、木耳、毛木耳、金针菇、双孢蘑菇、猴头、灰树花等,原种长满需4~6周。具体需时因品种、培养基、容器大小的不同而异。
  (五)、优良菌种特征与鉴别
  食用菌优良品种性状的鉴定需要生理、生化、栽培、抗逆性、抗杂力等多方面的鉴定,是选种育种工作必不可少的重要组成部分。作为菌种生产者对菌种的鉴别,不是指其使用品种的种性,而是在种性既定的前提下,对大量的扩繁后的菌种体生长状况的检查和优劣的鉴别。在使用品种种性优良,母种符合使用标准的前提下,原种和栽培种培养基适宜,灭菌彻底,接种操作规范,培养条件适宜,是完全可以生产出合格的原种和栽培种的。
  不同种、不同品种,甚至不同培养基,原种与栽培种的外观不完全相同,外观特征只有在品种相同、培养基相同、培养条件相同的前提下,才有可比性。这里介绍的菌种鉴别及特征主要应用于菌种培养期间,因此,这也是个动态的过程。尽管不同品种、不同培养基、不同培养条件下菌种外观有所不同,但在生长过程中,仍有不少共性,以资鉴别。优良的原种和栽培种应具备如下特征:
  1、生长整齐 同一品种,使用相同的培养基,在相同的条件下培养,长速和长相应基本相同。
  2、长速正常 不同种、不同品种、不同培养基、不同生长条件长速不同,但是每一个品种,在固定的培养基和培养条件下,有其固定的长速。如美味侧耳原种,在纯棉籽壳培养基上,装干料125~130克,湿重300~320克,在恒温2512下培养,应在21~25天长满。
  3、色泽正常 不同食用菌的母种虽然色泽略有差异,但在天然木质纤维质的培养基或谷粒培养基上生长时,几乎菌丝体都是白色。除草菇、银丝草菇外,几乎所有的食用菌正常的原种和栽培种外观均应纯白色。如果污染有其他真菌,从菌种外观可看到污染菌菌落的颜色,常污染食用菌菌种的菌落颜色有绿色、灰绿色、暗褐色、橘红色、灰白色、黑灰色等。有时污染菌的菌落被食用菌菌丝遮盖后,可出现明显可见的黄色或黄褐色的颉颃线。此外,整个菌种体上下不同部位还应色泽鲜亮一致。特别是当上部灰暗时,应拣出不用。如果整批出现上部灰暗苍白,色泽不鲜亮,应认真找原因,整批菌种销毁不用,重新制种。
  4、菌丝丰满 优良的原种和栽培种,菌丝丰满、浓密、均匀。如果菌丝干瘪,菌体上部萎缩,则不可使用,应认真分析原因,重新制作。
  5、菇香味浓郁 正常的原种和栽培种,打开瓶(袋)盖,可闻到浓郁的菇香味,如果气味清淡或无香味,说明菌种有问题,不能使用。
  (六)、主要食用菌原种和栽培种特征
  1、双孢蘑菇
  双孢蘑菇常用发酵过的粪草或谷粒作原种栽培种的培养基。在粪草培养基上,菌丝洁白至苍白色,粗细均匀,后期出现菌索,上下均匀一致,无扇形变异,无菌被,在23℃恒温培养条件下,原种750毫升菌种瓶25~30天长满瓶,栽培种要早5天左右满瓶。谷粒种菌丝浓白粗壮,遇高温时微黄,上下均匀一致。如果生长中就有菌被形成,说明过湿,如果生长不均匀,表明浸泡和预煮时间不够。若生长中菌丝渐变黄,表明培养温度过高,要多方采取降温措施。在高温条件下(超过23℃)培养的菌种,使用时不易吃料,发菌慢。
  2.香菇
  香菇菌丝洁白、舒展、均匀,生长边缘整齐,不易产生菌被。在常规木屑麦麸培养基上,在25℃恒温培养,750毫升菌种瓶,原种一般40~45天长满,在加有一定比例的玉米粉的木屑培养基上,菌丝更加浓密、洁白,生长期可缩短3天左右。在相对加富的各种培养基上,气生菌丝都有不同程度的增加。在较高的培养温度(30℃或更高)下,培养基中的菌丝稀疏,生长边缘可见的丝状不明显。在高温条件下,培养基表面易出现分泌物,这些分泌物常由无色透明渐变为黄色至褐色,其色泽的深浅与品种有关。一般而言,起源于日本的品种色素较浅,中国种则色素较深。香菇菌种在有光和低温刺激下,常在表面或贴壁处有菌丝聚集的头状物出现,这是短周期品种和易出菇的标志。生长良好的原种和栽培种有浓郁的香菇味。
  3、木耳
  菌丝洁白、浓密、粗壮,生长边缘整齐有力,菌丝粗细均匀整齐,上下一致。菌丝长满瓶后出现浅黄色水珠。长满瓶后在有光条件下出现胶质的耳基。如果菌丝出现不均匀的长势,木塞种出现斑块状或扇形生长,表明有细菌污染。
  4、平菇
  菌丝洁白、浓密、粗壮、鲜嫩,菌丝生长边缘整齐,比上述三种菌丝都粗壮而浓密。多数品种在培养基上方表面形成绒毛状气生菌丝,低温品种的气生菌丝常分泌黄色或黄褐色色素,特别是在高温季节,低温品种常出现“黄梢”,分泌黄色至黄褐色水珠,这都属正常现象。
  如果菌种体上部菌丝稀疏、灰暗、无力、干瘪,而下部或生长边缘正常,表明培养温度过高、湿度过大、通风不良,或有大量细菌生长。如果菌种体表面出现白粉状物,表明培养温度过高。在较晚发生毛霉污染时,平菇菌丝常能将毛霉菌丝遮盖,不经仔细观察,很难发现污染。没有菌种生产经验的人常把其作为正常菌种使用。在这种情况下仔细观察,可发现菌丝分布较乱,且色泽较暗或稍黄,菌丝也显更密集。完成培养后.在25℃以下,多数品种易在上表面形成子实体原基。
  5、草菇
  草菇菌丝灰白至灰黄色,透明或半透明,有光泽,粗壮但稀疏而蓬松。生长均匀,几日后便有红褐色至锈红色厚垣孢子产生。厚垣孢子初灰白色,渐色泽加深,直至红褐色或锈红色。在稻草、棉籽壳或废棉培养基上,一般14~18天长满瓶。满瓶后3~5天使用效果最好。
  6、灵芝
  菌丝浓密而洁白,短健整齐,生长均匀。表面易形成坚韧的菌被,菌被初白色,后渐变为黄色。在棉籽壳培养基上,在27~29℃下培养,原种25天左右长满瓶,栽培种18~20天满瓶。
  7、鸡腿菇
  菌丝浓密、洁白、粗壮,生长边缘整齐有力,在草料培养基上,在25℃恒温条件下培养,原种30~35天长满瓶(。750毫升),栽培种25~30天长满。
  8、阿魏侧耳
  菌丝浓密、洁白、粗壮,上下均匀一致,生长整齐,外观酷似平菇。生长较慢,在25℃恒温条件下培养,原种45~50天长满瓶(750毫升)。
  9、鲍鱼菇和盖囊菇
  菌丝洁白、浓密、粗壮,生长均匀整齐,表面有黑色分生孢子团。
  (七)、常见问题的分析和处理
  就一般情况而言,在品种优良,母种生长良好,培养基适宜,灭菌彻底,接种操作规范,培养条件适合的条件下,就能够生产出优良的原种和栽培种。然而在生产实践中,也常出现一些意想不到的问题,影响菌种生产的如期完成。归纳起来,常出现的问题及处理如下:
  1、接种物萌发不正常 主要表现为两种情况:一是不萌发或萌发缓慢;二是萌发出的菌丝纤细无力,扩展缓慢。
  这首先要检查培养温度是否适宜,培养温度过高常造成此类问题的发生。如果培养温度适宜,要检查培养料的含水量是否过低。培养料含水量严重不足时,极易造成接种物不萌发。
  如果含水量也适宜,就应从母种和培养基原料及灭菌效果上查找原因。总结上述,分析的思路应为:培养温度一培养基含水量一培养基原料质量一灭菌规程及效果一母种。对于接种物不萌发,或萌发缓慢,或扩展缓慢来说,这几个方面的因素必有其一,甚至可能是多因子的不良影响。
  ①、培养温度过高 造成接种物不萌发、萌发迟缓、生长迟缓。
  ②、含水量过低 尽管拌料时加水量充足,但由于拌料不均匀,造成培养基含水量的差异,含水量过低的菌种瓶(袋)接种物常干枯而死。发生这种情况,及早补水尚可挽救。
  ③、培养基原料霉变 正处霉变期的原料中有大量有害物质,这些物质耐热性极强,在高温下不易分解变性,甚至在高压高温灭菌后仍保留其毒性。接种后,菌种不萌发。这一因素的确定,需将培养基和已接种的种块取出,分别置于PDA培养基斜面上,于适宜温度下培养,不见任何杂菌长出,而种块则可萌发、生长。
  ④、灭菌不彻底 出现这一问题的灭菌不彻底,主要是培养基内留有大量细菌,而不是真菌。培养基中残留和继续繁殖增加的细菌,多数情况下无肉眼可见的菌落,有时在含水量过大的瓶(袋)壁上,在培养基的颗粒间可见到灰白色的茵膜。这一原因可通过培养基的分离培养得到证实。
  造成灭菌不彻底的原因有很多,将在下文有关污染问题分析中讨论。
  ⑤、母种菌龄过长 菌种生产者应使用菌龄适当的母种,多种食用菌母种使用最佳菌龄都在长满斜面后1~5天。在计划周密的情况下,母种和原种生产的紧密衔接是完全可行的。
  若母种长满斜面后一周内不能使用,要及早置于4~6℃下保存。
  2、发菌不良 发菌不良的表现多种多样,常见的有生长缓慢。生长过快但菌丝纤细稀疏,生长不均匀,菌丝不饱满,色泽灰暗等。造成发菌不良的原因主要有:
  ①、培养基酸碱度不适。可将发菌不良的菌种瓶(袋)的培养基挖出,用pH试纸测试。
  ②、原料中混有毒害物质,如松、杉、柏、樟、桉等树种的木屑,原料有过霉变,有霉菌毒素。
  ③、灭菌不彻底,培养基中生长有肉眼看不见的细菌。
  ④、装料过紧,水分过少,透气性过差。
  ⑤、培养室温度和湿度过高,空气流通交换不够。
  ⑥、培养基含水量过大,装得过紧。这种情况下,往往长至瓶(袋)中下部后,菌丝生长变缓,甚至不再生长。
  3、大量污染 在正常情况下,原种和栽培种的污染率在10%以下,各个环节和操作规范者,常只有1%~5%。如果超出这一范围,则应该认真查找原因。造成污染的原因大致有以下几方面:
  ①、灭菌不彻底 这一原因导致的污染发生特点是污染率高,出现早,污染出现的部位不规则,培养物的上中下各部位均出现杂菌。这种污染常培养3~5天就可出现。影响灭菌效果主要有以下几个因素:
  A、培养基的原料性质。不同材料导热性不同,微生物基数不同,灭菌所需时间也不同。因此,灭菌时要根据培养基的不同掌握灭菌时间。常用的培养基灭菌时间的关系是木屑<草料<木塞<粪草<谷粒,木屑种需时最短,谷粒种则最长。灭菌温度和灭菌时间必须严格按前文有关技术参数掌握,达到既要灭菌彻底,又要尽量少地破坏营养成分。因此,有条件的要尽量使用高压蒸汽灭菌。特别是粪草种和谷粒种。因为在高温条件下,微生物死亡比有机物破坏要来得快,从而达到缩短灭菌时间,既无菌又保护营养的目的,表3—5列出了细菌热致死温度和时间的关系。
  表3-5细菌热致死温度和时间的关系(分)
                     全部(100%)致死     
  细菌种类   90%致死所需时间     所需时间       温度(℃)
  营养细胞              2~3           50 
  芽 孢               30            7l 
  枯草杆菌     11.3       15~60          100 
嗜热脂肪芽孢杆菌   300        3 000          100 
 肉毒芽孢杆菌             300~530         100 
 产气荚膜杆菌    0.3~17.6                  100 
  丁酸杆菌     10~12                   85 
  从培养基原料的营养成分上说,糖、脂肪和蛋白质含量越高,传热性越差,对微生物有一定的保护作用,灭菌时间需要相对要长。
  从培养基的自然微生物基数上看,微生物基数越高,灭菌需时越长。因此,培养基加水配制均匀后,要及时灭菌,以免其中的微生物大量繁殖,培养基中微生物基数增加影响灭菌效高,出现早,污染出现的部位不规则,培养物的上中下各部位均出现杂菌。这种污染常培养3~5天就可出现。影响灭菌效果主要有以下几个因素:
  ①、培养基的原料性质 不同材料导热性不同,微生物基数不同,灭菌所需时间也不同。因此,灭菌时要根据培养基的不同掌握灭菌时间。常用的培养基灭菌时间的关系是木屑<草料<木塞<粪草<谷粒,木屑种需时最短,谷粒种则最长。灭菌温度和灭菌时间必须严格按前文有关技术参数掌握,达到既要灭菌彻底,又要尽量少地破坏营养成分。因此,有条件的要尽量使用高压蒸汽灭菌。特别是粪草种和谷粒种。因为在高温条件下,微生物死亡比有机物破坏要来得快,从而达到缩短灭菌时间,既无菌又保护营养的目的,表3—5列出了细菌热致死温度和时间的关系。
  表3-5细菌热致死温度和时间的关系(分)
全部(100%)致死
  细菌种类   90%致死所需时间      所需时间       温度(℃)
  营养细胞                2~3          50 
  芽 孢                 30           7l 
  枯草杆菌     11.3         15~60         100 
嗜热脂肪芽孢杆菌   300          3 000          100 
 肉毒芽孢杆菌               300~530         100 
 产气荚膜杆菌    0.3~17.6                   100 
  丁酸杆菌     10~12                    85 
  从培养基原料的营养成分上说,糖、脂肪和蛋白质含量越高,传热性越差,对微生物有一定的保护作用,灭菌时间需要相对要长。
 从培养基的自然微生物基数上看,微生物基数越高,灭菌需时越长。因此,培养基加水配制均匀后,要及时灭菌,以免其中的微生物大量繁殖,培养基中微生物基数增加影响灭菌效
  ②、容器 玻璃瓶较塑料袋热传导慢,在使用相同培养基、相同灭菌方法时,瓶装种灭菌时间要较塑料袋稍长。
  ③、灭菌方法 高压灭菌和常压灭菌这两种灭菌方法.相比较而言,高压灭菌可用于各种培养基的灭菌,而常压灭菌对于灭菌难度较大的粪草种和谷粒种达到完全灭菌效果就很不容易。因此,为了确保灭菌效果,建议粪草种和谷粒种采用高压灭菌。目前技术发达的日本、美国等专业菌种场已采用超高温瞬时灭菌技术。高压灭菌的关键是要排放冷气干净,否则,灭菌室不能形成饱和蒸汽压力,灭菌温度达不到压力表所指示压力的对应温度,达不到彻底灭菌的效果(表3—9)。
表3-9冷空气排放程度与锅内温度、压力的关系
             
      温度(℃)               
压力(兆帕) 完全排除 排除2/3 排除1/2 排除1/3 不定量排除
 0.035   109   100    94    90   72
 0.069   115   109    105   100   90
 0.103   121   115    112   109   100
 0.138   126   121    118   115   109
 0.172   130   126    124   121   115
 0.207   135   130    128   126   121

  常压灭菌要注意,砌灶时锅体与灭菌室的相对位置要合理。如果灶体圆形,锅垒在中央,若灶体方形或长方形,四个角距锅最远,灭菌时气温最低,灭菌效果不好。因此,最好把灶内四角砌成圆形,以便灶内均衡升温,同步灭菌。同时,灶顶砌成圆拱形,利于冷凝水沿四壁下流而不打湿棉塞,利于培养期减少污染。锅小、锅口小、水少、蒸汽不足、火力不足,致,且出现早,接种3~5天内就可肉眼鉴别。
  这类污染要靠严格检查菌种质量才能克服,不但使用前要认真仔细检查,而且要在培养全过程中连续检查和观察,以确保菌种纯度。
  ④、设备 设施过于简陋引起灭菌后无菌状态的改变 本来经灭菌的种瓶种袋已经达到了无菌状态,但由于灭菌后的冷却和接种环境达不到高度洁净无菌,特别是简易菌种场和自制菌种的菇农,达不到流水线作业专场专用,生产设备和生产环节分散,又往往忽略场地的大环境卫生,忽视冷却场地的洁净度,使本已无菌的种瓶种袋在冷却过程中就被污染。在冷却过程中,随着温度的降低,瓶内、袋内气压降低,冷却室如果灰尘过多,杂菌孢子基数过大,杂菌孢子就很自然地落到了种瓶或种袋的表面,而且随其内外气压的动态平衡向瓶内、袋内移动,当棉塞受潮后就更容易先在棉塞上定殖,或等待接种操作时碰触沉落进入瓶内或袋内。瓶袋外附有较多的灰尘和杂菌孢子时,成为接种操作污染的污染源。
  要克服这一问题,必须改变“人人制菌种”的小农生产意识,放弃粗放工艺和简陋设备制种的小农经济生产方式,提倡专业生产、规模生产、规范生产。
  ⑤、接种操作污染 接种操作造成的污染发生特点是分散出现在培养基上表面,较接种物带菌和灭菌不彻底造成的污染发生稍晚,一般接种后7天左右出现。接种操作的污染源主要是接种室空气和种瓶种袋冷却中附在表面的杂菌,有的接种操作人员自身洁净度不良,也是很重要的污染源,如违反接种操作规程,没有做到使用专用无菌的白大褂,或白大褂表面附着尘土和杂菌孢子,或不戴口罩和工作帽,手臂消毒不良等,都是接种操作的污染源。这些污染源的存在,都是接种操作的巨大威胁。因此,要避免或减少接种操作的污染需格外注意以下主要技术环节:
  A、不使棉塞打湿 灭菌码放时,切勿棉塞贴触锅壁,而要向内或向外,当棉塞向上摆放时,一定要用牛皮纸包扎。高压灭菌时要先夹层预热,进气由小到大。灭菌结束时,自然冷却.不要强制冷却。当冷却至一定程度后再微开锅门,让锅内的余热把棉塞上的水气蒸发。不可一次大开锅门,这样棉塞极易潮湿。
  B、洁净冷却 有条件的规范化的菌种场,冷却室是高度无菌的,要保持冷却室的高度无菌状态,简易菌种场和自制菌种的菇农,也要使冷却室尽量的无菌、洁净,最起码地面不能有可见的尘土,灭菌后的种瓶种袋不能直接放在有尘土的地面上冷却。最好在冷却场所地面上铺一层灭菌过的麻袋、布垫或用高锰酸钾液浸泡过的塑料薄膜。冷却场所使用前进行空气消毒,可紫外线灯和喷雾相结合消毒。
  C、接种室和接种箱使用前必须严格消毒 消毒处理前要将接种物和被接种物都码放好,以杀死它们容器表面附着的杂菌。
  D、接种操作人员必须在缓冲间穿戴专用衣帽 专用衣帽要定期洗涤,并不可置于接种室之外,要保持高度清洁。有灭菌条件的,最好每次用前灭菌,以减少污染源。没有每次灭菌条件的,穿上后用蘸有消毒液的潮湿的消毒巾擦拭前襟,以减少灰尘和杂菌孢子的沉落。进入接种室前要认真洗手,操作前用消毒剂认真消毒双手。
  E、接种过程要严格无菌操作,尽量少走动,少搬动,不说话,尽量小动作、快动作,以减少空气震动和流动,减少污染。
  F、必须在火焰上方接种 实际上无菌室内绝对无菌的只有酒精灯火焰周围很小的范围内。因此,接种操作,包括开盖、取种、接种、盖盖,都应在这个绝对无菌的小区完成,不可偏离。二人接种时,要密切配合。
  G、拔出棉塞使缓劲 拔棉塞时,不可用力直线上拔,而应旋转式缓劲拔出,以避免造成瓶内负压,外界空气突然进入而带人杂菌。
  H、湿塞换干塞 灭菌时,可同时带灭菌一些棉塞,留接种时换下打湿的棉塞。
  I、接种前做好一切准备工作,一次接种不间断,一气呵成。
  J、少量多次 每次接种室消毒处理后接种量不宜过大,接种室以一次200瓶以内,接种箱以一次100瓶以内效果为佳。如果生产量大,可多个接种室或昼夜轮流接种,切勿只图省工省时,消毒处理一次而大量接种。切记每次接种前都必须严格消毒处理。
  K、未经灭菌的物品切勿进入无菌的瓶内或袋内。接种操作时,接种钩、镊子等工具一旦触碰了非无菌物品,如试管外壁、种瓶外壁、操作台面等,决不可再直接用来取种、接种,必须重新进行火焰灼烧灭菌。掉在地上的棉塞、瓶盖切忌使用。
  ⑥、培养环境不洁及高湿 发生特点是,接种后污染率很低,随着培养时间的延长,污染率逐渐增高。这种污染较大量发生在接种10天以后,甚至培养基表面都已长满菌丝后贴瓶壁处陆续出现污染菌落。这种污染多发生在用废罐头瓶制作的原种和栽培种中。由于罐头瓶口大,不易封严,没有棉塞,常用聚丙烯薄膜封口,在洁净度不够的培养室极易出现大量污染。在有鼠、蚁、蟑螂等为害的情况下,使用塑料袋制种也常出现这类污染。
  4、综合预防和处理措施
  ①、使用优良品种,从有信誉的专业机构引进菌种,如食用菌专门研究单位的福建省三明市真菌研究所、上海市农科院食用菌研究所、华中农业大学应用真菌研究所、福建农业大学菌草研究室、湖南长沙湖南省食用菌研究所、河南省科学院生物所、浙江农业大学园艺系、浙江省农科院园艺所、山西省科学院生物所、广东省广州市广东省微生物所、辽宁省辽阳市食用菌研究所、辽宁省朝阳市食用菌研究所、黑龙江应用微生物研究所等。食用菌菌种的专业保藏管理机构我国也有数家,是广大食用菌生产者的很好的种质资源库,这些机构均能提供来源清楚、性状明确、种质优良的各种食用菌品种,这些专业机构有:中国农业微生物菌种保藏管理中心食用菌实验室(设在北京中国农业科学院土壤肥料研究所)、中国林业微生物菌种保藏管理中心(设在北京中国林业科学院内)、中国普通微生物菌种保藏管理中心(设在北京中国科学院微生物研究所)。
  为了确保菌种质量,切勿在菌种场、菇农间引种和交换。
  ②、按照食用菌菌种生产的特点规划和设计房屋,购置相应设备,提高专业化生产水平。
  ③、严格按照菌种生产的工艺技术要求选料、配料、分装、灭菌、冷却、接种、培养和检查。
  ④、严格挑选用于扩大的母种和原种,不使用有任何疑点的母种和原种,保证接种物的纯度。
  ⑤、提高人员技术素质,规范操作,规范生产,生产场地定期清洁、消毒,污染物定期灭菌处理,保持大环境的清洁状态良好。
  ⑥、专业菌种场要建立技术管理规章制度,以确保技术的准确到位,保证生产。
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发表于 2012-5-8 23:30:46 | 显示全部楼层
防螨虫,就有金雕防虫灵
很好的资料,但用液体种是不是更好呢?
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