灵芝多糖肽含量测定Lowry法及作为标准品的优势

春雨菌业

灵芝多糖肽含量的测定方法—Lowry法

      Lowry反应测定灵芝多肽的含量是浓缩脲方法的发展，第一步涉及到在碱性溶液中铜-蛋白质复合物的形成，然后这个复合物中酷氨酸和色氨酸残基还原磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin氏试剂），产生深蓝色化合物。

      【对照品溶液的制备】将牛血清白蛋白配制成0.3mg/ml溶液，即得。

      【Folin-酚试剂的配置】

      碱性铜试液：取氢氧化钠10g，碳酸钠50g，加水400ml使溶解，作为甲液；取酒石酸钾0.5g，加水50ml使溶解，另取硫酸铜0.25g，加水30ml使溶解，将两液混和，作为乙液，并加水至500ml。

      福林酚试液：取市售福林酚贮备液，按1：16比例稀释，即得。

      【标准曲线的绘制】精密量取对照品溶液0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别置于具塞试管中，各加水至1.0ml，再加碱性铜试液1.0ml，摇匀，室温放置10分钟后，加入福林酚试液4.0ml，摇匀，于55℃的水浴中保持5分钟，取出，放冷至室温。以0管为空白，照分光光度法（《中国药典》2000年版第二部附录）在750nm波长处测定吸光度。以牛血清白蛋白的浓度为横坐标，与其对应的吸光值为横坐标绘制标准曲线。

      【供试品溶液的制备】准确称取粉碎的灵芝子实体5g置于100ml锥形瓶中，加水20倍体积蒸馏水，60℃下超声30min，冷却后过滤，得滤液①。滤渣再加入10倍体积的蒸馏水，60℃下超声。20min，冷却后过滤得滤液②。滤渣再加入10倍体积蒸馏水，60℃下超声20min，冷却后过滤，得滤液③。合并①②③滤液，蒸发浓缩，400rpm离心20分钟，定容100ml，精确量取定容量4ml，加12m无水乙醇，l0000rpm离心10min，沉淀加水溶解，定容至10ml。

      【样品测定】精确量取供试品溶液1.0ml，再加碱性铜试液1.0ml，摇匀，室温放置10分钟后，加入福林酚试液10ml，摇匀，于55℃水浴中保温5分钟，取出，放冷至室温。以标准曲线0管为空白，在750nm波长处测定吸收度，由回归方程计算，即得灵芝多糖肽的含量。

      灵芝多糖肽相比葡萄糖作为灵芝多糖标准品的优势所在

      灵芝多糖是灵芝的重要有效成分，目前多以灵芝多糖含量作为灵芝子实体（生药材）及灵芝产品的含量测定标准。《中华人民共和国药典》2005年版一部“灵芝含量测定”项规定，干燥的灵芝子实体“含灵芝多糖以无水葡萄糖（C6H12O6）计，不得少于0.5%”。目前，灵芝产品均是根据药典的方法以葡萄糖作为标准品来测定灵芝多糖的含量。

      由于制作工艺的要求，生产灵芝制剂时均要加入辅料。如灵芝提取液浓缩喷雾成精粉时，需要加入糊精；生产灵芝片或胶囊时，先要在灵芝提取物中加入淀粉制粒，然后再压片或制成胶囊；灵芝冲剂也同样要用淀粉制粒。此外，再填充胶囊时，常用淀粉做填充剂。因此，如以葡萄糖作标准品的话，所测灵芝产品的灵芝多糖含量就非常不准确了，加淀粉、糊精越多，“灵芝多糖”含量就越高，导致出现很多假象。因此灵芝产品的标识的灵芝多糖含量至少是包括灵芝和淀粉/糊精所含葡萄糖的总和，并非单一灵芝所含葡萄糖的量。加入淀粉越多，“灵芝多糖”就越多，故不一定“灵芝多糖”含量高的产品就比含量低的产品好。

      如何解决这一难题？最近，我们从灵芝中提取、纯化出一种灵芝多糖肽，用它代替葡萄糖作为标准品，即可区别灵芝多糖和葡萄糖。因此就可以避免淀粉等造成的假象了。