灵芝多糖类的提取分离、纯化和纯度的测定

春雨菌业

多糖类化合物是灵芝所含化学成分之一，大量研究现已证明，灵芝多糖类具有抗肿瘤作用、免疫调节作用、降血糖作用、降血脂作用、抗氧化作用和抗衰老作用，故灵芝多糖类是灵芝的主要有效成分。临床试验也证实，灵芝多糖可作为肿瘤化学治疗和放射治疗的有效辅助治疗药。有关灵芝多糖类的分离、纯化、结构确证的研究方兴未艾，也是目前灵芝研究的热点和重点。

      一、灵芝多糖类的提取分离

      从灵芝中提取多糖类物质主要根据去能溶于水、稀碱、稀酸而不溶于醇酮醚等有机溶剂的性质进行提取分离。最常见的方法为热水提取法。将灵芝与水以1：（10～15）比例于90～100℃提取2～3次，每次1小时。合并提取液并浓缩至原体积的1/（10～15），加3～5倍乙醇使多糖沉淀析出。离心、沉淀、水溶解、透析、浓缩、醇沉反复两次纯化，而得灵芝多糖类物资。该物质在透析前去除游离蛋白质，得到多糖。实验室常用Sevag法除去游离蛋白质，它是将氯仿：正丁醇=5:1（V/V）的比例，加入多糖水溶液中，多次振荡，使蛋白质变性，从乳化层中除去。

      实验室提取灵芝多糖肽先用乙醇（或甲醇）回流脱脂及去除杂质，而制得脱脂灵芝再用水提取。提取多糖类除用水以外，也采用稀碱（0.1～1.0mol/L NaOH）提取，但要注意的是提取时间宜短，温度不要超过50℃，以免糖苷键的断裂，稀碱提取液应迅速中和、透析，也可用含酸乙醇沉淀得碱溶性多糖。此外，也可用酶法提取。

      二、灵芝多糖类的纯化

      除去游离蛋白质及小分子杂质后得到灵芝总多糖类，它含有多糖和多糖肽多个均一体，分子量分布范围较宽，不适宜进行化学结构分析，需进一步分离纯化得到分子量分布范围较窄的单一组分，才能进行深入的化学结构研究。灵芝多糖类常用的纯化方法有分级沉淀法、凝胶柱层析法、离心交换层析和超滤技术扥，实际操作中常常是几种方法配合使用，才能达到较好的分离纯化效果。

      （一）分级沉淀法

      依据不同分子大小的灵芝多糖（肽）在不同浓度的醇（甲醇或乙醇）中溶解度不同，依次沉淀析出。可将灵芝总多糖类配制成合适的水溶液（1%～3%），离心弃去杂质。

      （二）离子交换层析

      用于灵芝多糖类离子交换层析的交换剂有弱碱性阴离子交换剂，主要有以下几种：

      1.DEAE-纤维素  DEAE-纤维素分离灵芝多糖类是常见的方法之一。其优点是：它是开放性长链，具有较大的表面积，吸附容量大；其次是具有良好的稳定性，洗脱剂的选择范围广，第三离子基团少，排列稀疏，与多糖类结合不太牢固，易于洗脱。

      2.DEAE-葡聚糖凝胶  葡聚糖凝胶离子交换剂具有离子交换和分子筛的双重作用，对灵芝多糖类有很高的分辨率。

      3.DEAE-琼脂糖凝胶 适合相对分子量较大多糖的分离，即使加快流速，也不影响分辨率。适用于灵芝多糖类的离子交换剂常采用的类型为DEAE-Sepharose 4B和6B。

      （三）凝胶层析法

      用于灵芝多糖肽分离的凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等。

      （四）超滤技术

      超滤法是综合了过滤和透析技术的优点而发展起来的一种高效分子分离技术。是灵芝多糖类脱盐、浓缩、分级分离常用的方法。

      三、灵芝多糖类纯度的测定

      灵芝多糖类的纯度实质是一定分子量范围的均一组分。纯度鉴定常有四种方法：比旋度法、超滤法、高压电泳法和凝胶过滤法。前三种误差较大，所以必须要有两种以上方法检测，得到结果才能肯定期均一性。正常最常用切较正确的方法是第四种方法。凝胶过滤法又称凝胶柱层析法，它又分常压柱层析和高压柱层析两种。

      1.常压柱层析 层析柱可以自己填充，其装置简单。罗立新（1998）在Sephadex G-200层析柱（2.0cm×2.0cm）内，用0.1mol/L Nacl平衡，取10mg样品溶解后，上柱，用0.1mol/L Nacl洗脱，流速10ml/h，分部收集，蒽酮-硫酸法检测多糖，结果为单一对称洗脱蜂，说明多糖样品是纯的。

      2.高压柱层析 随着耐高压合成凝胶的出现，高压柱层析，即HPGPC已应用于多糖类纯度测定，使该工作取得较大的突破。它有着速度快、高分辨率和重现性好等优点。最近我们用此法检测灵芝子实体中分离出的多糖肽GL-LPP-3的纯度，结果显示为对称峰。

      灵芝及其制剂在临床上应用比较多，其质量控制问题一直是许多生产厂家和科研工作者研究的课题，但在这方面的报道并不多，根据我们多年对灵芝的研究的经验，认为应以多糖和三萜的含量做为栽培和野生灵芝的质量控制标准，这是因为灵芝含有较多的多糖，而且这些多糖大多具有提高免疫功能的作用，这与灵芝滋补强壮、扶正固本的作用是一致的。