灵芝深层发酵菌丝体培养基及影响因素

春雨菌业

一、灵芝深层发酵菌丝体培养基培养基成分

     灵芝菌丝体通过培养基分解和吸收所必需的营养。培养基还应满足菌丝体生长时所选要的酸碱度和适当的渗透压。培养基可采用化学成分已知的碳水化合物、含氮化合物、无机盐类和生长因子等作为营养物质配制而成，也可有天然物质（如马铃薯、蛋白胶、麦芽汁、酵母膏）配制。前者按化学成分一定比例组成培养基称为合成培养基；后者按一定天然物质的含量组成称为天然培养基。还有一种含有一定量的天然物质外，还适量增添一些微量的化学物质，称为半合成培养基。

      现将灵芝液体培养基成分介绍如下：

    （一）碳源

      培养基的碳源主要是用来供应菌丝体生命活动所需要的能量和构成菌体细胞以及代谢产物的物质基础。灵芝深层培养的碳源有葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉等。培养基中糖的浓度为2%左右，培养基中糖过量时，常阻碍空气中氧的溶解，不利于沉没菌丝体的生长。灵芝菌丝在玉米淀粉会麦芽糖中生长快，其他碳源较差。灵芝菌丝体对碳源的利用比较如下：

      2%麦芽糖+基础培养基＞2%玉米淀粉+基础培养基＞2%葡萄糖+基础培养基＞2%蔗糖+基础培养基。

      基础培养基：硫酸铵0.2%、硫酸镁0.05%、硫酸亚铁0.001%、磷酸二氢钾00.1%、氯化钠0.2%。

      在不同的碳源进行摇瓶培养，测定胞外多糖（g/l），其中碳源为玉米淀粉，葡萄糖时，粗多糖含量较高，其次为麦芽糖和蔗糖等。

      李平作等（1998）认为酒槽中含有的纤维素、半纤维素和核苷酸类物质，有利于菌丝体的生长和多糖的形成，作为菌丝体胞外多糖合成的前体诱导物质促使胞外多糖的大量合成。

      余素萍等（2005）指出灵芝菌丝体培养最适合碳源为玉米粉和可溶性淀粉，此时菌丝三萜产量最高。

      （二）氮源

      培养基中的氮源主要用来构成菌体细胞物质。通常所用的氮源可分为有机氮源和无机氮源两大类。前者如黄豆饼粉、花生饼粉、玉米浆、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉等；后者如硫酸铵、尿素、氯化铵、硝酸铵、硝酸钾。

      灵芝能很好地利用有机氮，而利用无机氮较差。灵芝菌丝体对氮源的利用结果如下：

      0.2%蛋白胶+基础培养基＞花生饼粉+基础培养基＞黄豆饼粉末+基础培养基＞酵母粉+基础培养基＞基础培养基+0.2%硫酸铵＞基础培养基+0.2%KNO3。

      基础培养基：葡萄糖2%、硫酸镁0.05%、硫酸亚铁0.001%、磷酸二氢钾0.1%、氯化钠0.2%。

      以有机氮源进行灵芝生成发酵时，菌丝体生物量及胞外粗多糖的产率都明显高于无机氮源。

      余素萍等（2005）指出灵芝菌丝体培养最适氮源为都饼粉，此时菌丝三萜产量最高。

      （三）无机盐

      灵芝在深层培养时需要少量无机盐，如磷、钾、硫、镁、钙等盐类，其中以磷和钾最重要。灵芝菌丝在缺少磷酸盐的培养基中菌体生长最差，故在深层培养基中必须添加0.05%的磷酸盐，而天然培养基和自来水中岁寒的其他微量无机盐已足以满足灵芝菌丝体生长的需要。在培养过程中由于灵芝菌丝发酵产生有机酸，为了维持PH不至于波动过大，往往在培养基中加入适量的磷酸钙。

      （四）培养基的选择

      灵芝深层发酵培养基的选择，一是促进菌丝生长；二是有利于有效物质的积累。除了全面考虑碳源、氮源的组成外，还要考虑合适的碳氮比例，以及无机盐和PH等因素。

      碳氮比对灵芝生曾发酵菌丝体的产量和代谢产物（如多糖类和三萜类物质）影响很大。碳源浓度过高会太低均不利于胞外多糖产率的体改。氮源浓度太高时，菌体量明显提高，胞外多糖产量明显下降；在氮源宁都太低时，菌体生长不良，多糖产量也下降，只有在适宜的碳氮比，才能获得理想的菌体产量和代谢产物。一般深层发酵培养基的碳氮比20～25：1左右，因此灵芝发佳品培养基碳源浓度应控制在2%～4%；氮源浓度应控制在0.1%～0.3%。理想的培养基要通过摇瓶培养正交优选实验，来确定灵芝深层发酵的最佳培养基组成。

      （五）灵芝培养基的正交试验

      灵芝菌丝发酵培养配方筛选，采用正交实验设计法，正交试验设计组数是水平数的平方整数倍。

      1.试验设计 按培养基成分设计一般为四因素三水平正交实验，或四因素和九水平实验。从极差值可看出影响灵芝菌丝体产量和代谢产物含量的主要因素和次要因素。

      2.试验条件 按设计因素和水平组合，培养基的各主要成分均煮沸25分钟，用纱布过滤，取滤液定容至100ml，摇瓶装量统一为100ml/250ml。如考察通气量对灵芝生长和代谢产物的影响时，摇瓶量为每500ml三角瓶，分别装入50ml、100ml、150ml、200ml等组，或控制转速快慢进行观察。

      3.主要设备 旋转摇床（偏心距4cm），可控温度和转速。

      4.碳氮源试验配制

      5.灵芝菌丝体最适合配方实例

      例一、张厚程（2003）：灵芝菌丝G22在葡萄糖1%、蛋白胶1.5%、KH2PO4 0.15%、MgSO4 0.075%、PH自然，多糖产量2.85g/L。

      例二、余素萍等（2004）：灵芝菌丝G7对胞内多糖产量影响顺序依次是可溶性淀粉、MgSO4、豆饼粉，最佳配方是淀粉4%、豆饼粉1%、MgSO4 0.025%、KH2PO4 0.15%，培养60小时胞内多糖产量高达5.33mg/ml。

      二、影响发酵灵芝菌丝培养基质量的因素

      在灵芝菌丝深层发酵过程中，经常会出现产量不稳定或菌体代谢异常等现象。其产生原因有多方面，除了灵芝菌种质量不稳定、发酵条件控制不严格外，培养基的质量也是一个重要因素。

      （一）原料的新鲜程度

      工业生产上的氮元素原料主要是玉米淀粉、玉米粉、糊精、糖密、氮氢化合物等。主要氮源包括豆饼粉、麦麸、蚕蛹粉、鱼粉等。这些原料早投入生产时，对每一批原料药进行化学成分分析。

      （二）水质影响

      工业生产使用的水有深井、自来水、地表水等。在生产中要对所采用的灵芝的质量、卫生标准定期进行化学分析。

      （三）高温灭菌的影响

      在灵芝菌丝深层发酵生产过程中，都是采用高压蒸汽方法灭培养基中的杂菌。在生产中除了控制好灭菌温度和时间外，还要尽量避免糖类与其他成分在灭菌过程中相互接触，最好件糖类与能其化学反应的成分分别灭菌，以提高灭菌的质量。