羊肚菌原生质体制备与再生(转）

春雨菌业

菌
物 系 统 22（3）：498~501, 2003

Mycosystema

羊肚菌原生质体制备与再生?

崔宗强

罗信昌

(华中农业大学应用真菌研究室 武汉 430070 ; 云南大学发酵重点实验室 昆明 650091)

摘 要: 羊肚菌原生质体制备的最佳条件为：以培养 3d 的菌丝体为材料, 0.6mol/L蔗糖溶液为

稳渗剂，1.5%浓度的溶壁酶 30℃条件下酶解 3 个小时，可得原生质体产量最高为 3.35×106个

/100mg。 以 0.6mol/L 的蔗糖溶液做稳渗剂， CYM 再生培养基上得到原生质体再生率为

0.171%。这一研究结果为羊肚菌通过原生质体技术进行菌株的遗传改良提供了重要技术参数。

关键词: 菌丝体；酶解；原生质体产量；再生率

中图分类号：Q939.5

文献标识码：A

文章编号：1007-3515（2003）03-0498-0501

食用菌原生质体技术在80 年代得到了迅速发展和广泛应用，现在已是食用菌生理、生化、

遗传等基础理论研究和食用菌菌种改良的一种重要方法和有效的工具（杨新美，1998）。羊肚

菌 Morchella 味道鲜美，营养丰富，且具有很好的医药保健功效，是一种极具开发价值的食、

药两用菌（龙正海，1977；张广伦等，1999）。本试验以羊肚菌的菌种改良为目的，探讨了原

生质体制备和再生等条件。

1.材料与方法

1.1 供试菌株

小顶羊肚菌 M. angusticeps，编号 ma-1, 引自美国。菌种保存于 CYM 固体培养基上。

1.2 培养基

1.2.1 完全酵母培养基(CYM)，配方：葡萄糖 20g，蛋白胨 2g，酵母膏 1g，硫酸镁 0.5g，磷酸

二氢钾 0.46g，磷酸氢二钾 1g，琼脂 20g，蒸馏水 1000ml。

1.2.2 LCYM:CYM 培养基中不加琼脂。

1.2.3 原生质体再生培养基：CYM 中分别加入 0.6mol/LMgSO4、KCl、甘露醇、蔗糖。

1.3 试剂及配制

溶壁酶（lywallzyme）,为广东微生物研究所产品。稳渗剂分别采用 MgSO4、KCl、甘露醇、

蔗糖配制。按试验要求称取一定量的酶溶于配制好的特定浓度的稳渗剂中，经装有 0.4μm 滤

膜的细菌过滤器除菌，4℃ 下保存备用。

1.4 试验方法

1.4.1 原生质体制备

1.4.1.1 菌丝体培养： 菌种先在 CYM 平板上 20℃活化 4 天后，用直径 5mm 的打孔器打取边

?

云南大学发酵重点实验室资助项目

收原稿日期：2002-11-27，收修改稿日期：2003-01-283 期

崔宗强等：羊肚菌原生质体制备与再生　

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缘生长点菌丝块。挑取菌丝块，接于装有 50ml LCYM培养液的 150ml 的三角瓶中，每瓶接 5

块，静置培养4d 然后把培养好的菌丝体用研磨器研磨，再接入新的 LCYM培养基中于 25℃

下静置培养。

1.4.1.2 原生质体制备、纯化与计数： 取培养好的幼嫩菌丝体离心（3000r/min，20min），倒

去上清液用无菌水洗涤两次，再用无菌滤纸吸去水分。取约 0.2g 菌丝体加入酶液 2ml，水浴

中酶解,间隙振荡，可获得原生质体悬浮液。酶解后的原生质体悬浮液经脱脂棉柱（5ml 注射

器中塞入 0.5~1.0cm 高的脱脂棉，稍压实）过滤除去残余菌丝，滤液离心（4000r/min，20min），

在管底侧处可见到原生质体的沉淀，用稳渗剂悬浮，重复离心、悬浮两次。血球计数板计数。

1.4.2 原生质体再生：分别采用以 0.6ml/L MgSO4、0.6mol/L KCl、0.6mol/L 甘露醇、0.6mol/L

蔗糖作为稳渗剂的再生培养基，同时以不加稳渗剂的 CYM 培养基作对照，将制备好的原生

质体稀释至合适浓度，取 100μl 涂平板。24℃下培养，观察平板中原生质体的再生情况并统

计再生菌落数，计算再生率。

再生培养基上长出的菌落数?对照培养基上长出的菌落数

原生质体的再生率 =

×100%

涂布的原生质体总数

2.结果与分析

2.1 原生质体制备 （见图 1）

图 1 原生质体分离、纯化和再生

1~2 原生质体；3~4 原生质体纯化；5~-6 原生质体再生

Fig. 1 protoplast isolation，purification and regeneration

1~-2 Protoplast isolation；3~4 Pure protoplast；5~6 Protoplast regeneration

2.1.1 酶解时间与原生质体产量关系：以 0.6mol/L 的溶液做稳渗剂配制浓度为 1.5%的酶液,

30℃水浴中酶解，结果为酶解 3h 羊肚菌的原生质体得率最大，为 1.70×106 个/100mg，酶解

4h 时，原生质体产量则又有所下降。500

菌 物 系 统

22 卷

2.1.2 稳渗剂浓度对原生质体产量的影响：分别以 0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L 的 MgSO4溶

液作稳渗剂配制浓度为 1.5%的酶液，30℃水浴中酶解 3 小时，测其原生质体得率。可知稳渗

剂浓度为 0.6mol/L时，原生质体得率最大。

2.1.3 酶液 PH 值对原生质体产量的影响：以 0.6mol/L 的 MgSO4作稳渗剂以 1mol/L NaOH 和

1mol/L HCl 调节 pH 值，30℃水浴中酶解 3 小时，测得酶液 pH 为 6 时原生质体得率最高，为

1.75×106个/100mg,pH5 与 pH6 差别不大，酶液 pH 为 4 时，原生质体得率则很低，只有 0.3×

106个/100mg。

2.1.4 稳渗剂种类对原生质体产量的影响：分别以0.6mol/L的甘露醇、0.6mol/L的KCl、0.6mol/L

的 MgSO4、0.6mol/L蔗糖作稳渗剂配制 1.5%的酶液，30℃水浴中酶解 3h，原生质体产量结果

见表 1。可知以 0.6mol/L 的蔗糖为稳渗剂，原生质体得率最高为 3.25×106个/100mg，其余为

甘露醇>MgSO4>KCl。

表 1 稳渗剂种类对原生质体产量的影响

Table 1 The effect of different osmotic stabilizers on protoplast yield

稳渗剂 Osmotic stabilizer

原生质体产量 Protoplast yield

（0.6mol/L）

（×106个/100mg）

蔗糖

3.25

甘露醇

1.90

MgSO4

1.75

KCl

1.65

2.1.5 酶解温度对原生质产量的影响：以 0.6mol/L 的蔗糖做稳渗剂配制 1.5%的酶液，分别于

不同温度的水浴中水解培养 3d 的菌丝，酶解3 h，测原生质体产量，结果表明30℃为最佳酶解

温度，原生质体产量达到高峰，3.25×106个/100mg，超过 30℃，原生质体产量下降。

2.1.6 菌丝体培养时间对原生质产量的影响：以 0.6mol/L 的蔗糖做稳渗剂配制 1.5%的酶液，

于 30℃水浴中分别酶解培养了 2d、3d、4d 和 5d 的羊肚菌菌丝来制备原生质体，酶解 3h。结

果表明，3d 是最适宜的菌丝培养时间，原生质体产量为 3.35×106个/100mg，随培养时间的延

长，原生质体产量下降。

2.2 原生质体再生

2.2.1 再生过程： 将试验 2.1.1 中酶解 3 h 时制备的原生质体用于再生试验，将其定容为 1.70

×105个/ml，取 100ul 涂布于再生培养基。培养 2d 后以蔗糖作稳渗剂的 CYM 平板上已有微

小再生菌落出现，第 3d 大部分菌落已非常明显， 以甘露醇为稳渗剂的平板上菌落出现稍慢

些，以 MgSO4为稳渗剂的平板上到第 4d 才有明显菌落出现。

2.2.2 再生频率： 试验比较了分别以 MgSO4，KCl，蔗糖，甘露醇作为再生培养基稳渗剂对再

生频率的影响,结果见表2。从表中可以看出以蔗糖作为再生培养基的稳渗剂时，原生质体再生

率最高，为 0.171%，其次为甘露醇，而以 KCl 为再生培养基的稳渗剂时很难获得再生菌落。3 期

崔宗强等：羊肚菌原生质体制备与再生　

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2 讨论

在羊肚菌原生质体制备过程中，与其他如平菇等原生质体制备不同，羊肚菌菌丝壁不能完

全酶解，有许多原生质体被限制在部分酶解的细胞壁内而难以释放出来，这可能是与羊肚菌菌

丝细胞壁组成中有大量的 S-葡聚糖有关，本试验中所用的溶壁酶富含纤维素酶活性，但缺乏

S-葡聚糖酶活性，所以在制备羊肚菌原生质体时可以考虑再同时加入具有 S-葡聚糖酶活性的

酶。本试验中原生质体再生率较低，最高也只有 0.171%。分析其原因，可能是由于羊肚菌菌

丝细胞多核（Volk & Leonard,1990）（荧光显微观察，每个细胞中有 1~2 个核，5~6 个核，甚至

20~30 个核不等），所制备的原生质体大小、核数目多少的差异相当大。另外，在此基础上，通

过原生质体诱变，原生质体融合等技术手段，对羊肚菌进行菌种改良，值得进一步探索。

表 2 再生培养基的稳渗剂与再生率的关系

Table 2 The relation of osmotic stabilizer of medium for regeneration and regeneration rate of protoplasts

稳渗剂 Osmotic stabilizer

再 生 率

（0.6mol/L）

Regeneration ratio

蔗糖

0.171%

甘露醇

0.135%

MgSO4

0.088%

KCl

0.006%

[REFERENCES]

Volk T J, Leonard T J, 1990. Cytology of the life cycle of Morchella. Mycological Research 94 (3): 399~406

　

［中文参考文献］　

龙正海, 1997. 羊肚菌的研究及应用开发前景. 中国生化药物杂志，18 (3): 160~161

张广伦, 卫明, 李 浩, 1999. 羊肚菌的研究与利用. 中国野生植物资源，18 (1): 1~4

杨新美, 1998. 食用菌研究法. 北京：中国农业出版社. 200~216

PROTOPLAST ISOLATION AND REGENERATION OF MORCHELLA

CUI Zong-Qiang

LUO Xin-Chang

(Institute of Applied Mycology, Huazhong Agricultural University, Wuhan, 430070; Key Laboratory of Fermentation,Yunnan

University,Kunming,650091)

ABSTRACT：For the protoplast isolation of Morchella, the optimal age of mycelia was 3d and 0.6ml/L sucrose

was the best osmotic stabilizer. The optimal enzymolysis temperature was 30℃and optimal enzymolysis time

was 3h. The highest protoplast yield was 3.35×106/100mg. When 0.6mol/L sucrose was used for stabilizer of

the regeneration medium of CYM, the regeneration frequency of protoplast was 0.171%. These results and data

would provide important parameters for the strain improvement of Morchella through the protoplast technique.

KEY WORDS: Mycelia, enzymolysis, protoplast yield, regeneration ratio