食用菌制种技术

春雨菌业

食用菌的菌种制作和培育
　　菌种，好比农作物的种子，是食用菌生产的根本，菌种的优劣直接影响食用菌的产量与质量。食用菌的菌种可分为母种、原种和栽培种。在菌种的培育过程中，需要一定的操作技术和设备用具。
　　（一）、接种室与接种箱　接种室与接种箱能够造成局部的无菌环境。因为食用菌的菌种培育工作，要求在严密的无菌条件下进行。
　　接种室要求门窗（最好无窗）关闭严密，便于消毒，究竟不宜过大，长2米、宽2米、高2米即可。室内装有日光灯和紫外线灯。
　　接种箱在母种及原种培育或栽培种生产量不大时，可在接种箱内进行。箱内也要装有日光灯和紫外线灯，正面有玻璃窗，以保证操作与消毒方便。
　　（二）高压灭菌锅与土蒸锅　高压灭菌锅全称是高压蒸汽灭菌锅，有手提式、立式和卧式三种。高压灭菌锅的优点是灭菌时间短、效果好、省燃料。
　　土蒸锅可用砖、水泥垒制而成，也可用大号铁锅代替。其优点是容量大，投资小，适于大批量生产。缺点是占地面积大，灭菌时间长（锅内湿度最高达100摄氏度，需维持6－8小时才能达到灭菌效果），费燃料。
　　（三）恒温箱和培养室　恒温箱即恒温培养箱，适用于母种及原种的恒温培养，可根据不同菌种对湿度的要求进行调节。
　　培养室用于大量生产菌种。培养室要求保温、洁净、干燥，室内有加热和通风设备以及放置菌种袋（瓶）的架子。
　　（四）培养菌种的容器　有试管、菌种瓶、塑料袋等。试管多用于母种培育。试管容量小，易操作，不易感染杂菌。
　　菌种瓶用于培养原种和栽培种。罐头瓶、酒瓶、广口瓶和料瓶的代用品。其优点是成本低，便于运输，装料与取菌均方便，但杂菌感染率略高于瓶装菌种。
　　（五）接种工具　主要用镊子和接种针。镊子的规格不一，可根据需要选择。主要用于原种扩大繁殖及培育栽培种。
　　接种针用于繁殖及培育原种，可用自行车辐条制成各种式样的接种针。
　　（六）化学试剂及药品　　无机盐和消毒剂。
　　食用菌除需要碳、氮营养外，还需要适量的磷、硫、钙、钾、镁等元素，这些元素需要由无机盐类供给。常用的有磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、石灰（CaSO4.2H2O）、碳酸钙、碳酸镁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸亚铁等。有些无机盐还有缓冲培养基酸碱度的作用。
　　消毒剂有酒精、甲醛、石碳酸、升汞水、来苏尔等。
　　二、菌种的培育
　　用食用菌的孢子或某种部分组织在营养基质上培育出的菌丝体称为母种也叫一级菌种。
　　（一）母种培养基的配制与灭菌　培养基是供食用菌生长发育所需养分配制而成的营养基质。菌种的不同发育阶段所需培养基的原料成分也不尽相同。
　　1、母种培养基的配制　　马铃薯葡萄糖琼脂培养基（简称PDA培养基）：马铃薯200克＋葡萄糖20克＋琼脂20克＋水至100毫升（下同）。
　　制法：将马铃薯洗去皮去芽眼，切成蚕豆大小，天平称取200克，放500毫升水中煮沸30分钟，用4层纱布过滤，取汁液，加水至1000毫升，放入20克琼脂继续加热，搅拌到溶化，加葡萄糖20克搅溶，加水定容至1000毫升即成PDA培养基。
　　PDA培养基是使用最广泛的囊培养基，几乎对所有的母种都适合。
　　此外还有马铃薯蔗糖琼脂培养基（简称PSA培养基）、马铃薯琼脂培养基（简称PA培养基）和综合马铃薯培养基等。
　　2、母种培养基的灭菌　　灭菌又称消毒，是用物理或化学方法杀死一切微生物。国土资源部厮灭菌是菌种培养的重要环节。灭菌有高压灭菌和常压灭菌两种。高压灭菌省时间省燃料，灭菌效果好，尤其对母种培养基的灭菌，多采用高压灭菌方法。高压灭菌的器具是高压灭菌锅。　　灭菌后的培养基，需进行无菌测定，方法是随意抽出3支试管置恒温箱中，25－28摄氏度恒温培养3天，培养基表面仍光滑如初，无菌落出现，证明灭菌彻底，可供接种使用。
　　（二）母种的培育方法　　母种的培育过程分为选择种菇、母种分离、接种、扩大繁殖四个过程。
　　1、种菇的选择　　用作母种分离的种菇，应选择出菇早、朵型好、个体肥大、生长健壮、菌柄长短适中、无杂菌、无病虫害、八成熟的为宜。
　　2、母种的分离　　要想获得纯种，就须通过孢子分离、组织分离和基质内分离三种方法进行。
　　（1）孢子分离法　　分为单孢子分离和多孢子分离两种。
　　单孢子分离，即在培养基上只接一个担孢子，由它萌发成菌丝体而获得纯菌种的方法。此法技术复杂，生产上很少采用，因此不作详细介绍。
　　多孢子分离，即把许多孢子接种于同一培养基上，使它们萌发、自由酱来获得纯菌种的方法。此间歇的行，生产上经常采用。其具体操作方法有经下几种。
　　种菇孢子佳节又重阳弹射法　　把选择好的种菇，除去菌柄，用75%酒精将菌盖表面揩擦消毒，在接种箱内，通过无菌操作，用铁支架把种菇菌褶朝下支撑在距离培养皿2厘米处，外罩玻璃罩，下铺无菌纱布，室温下静止12－24小时，菌褶上的孢子就会弹落到培养皿内。通过无菌操作，用接种针沾取少量孢子涤于试管斜面培养基上，在25摄氏度恒温下培养3－4天，孢子便萌发成菌落。选其中孢子萌发早，长势好的菌落，从边缘挑取小块菌丝，进行转管培养。
　　此外还有，钩悬法、贴附法等。
　　（2）组织分离法　　此法操作简便，取材广泛，菌丝萌发快，后代能保持原菌株的优良性状，不易发生变异。但如果种菇感染了病毒杂菌，则用此法得到的菌丝容易退化；种菇太老、太大，此法得到的菌丝成活率也很低。因幼菇再生力强，所以在组织培养时多选择幼茹种菇。
　　不同的食用菌，组织割取的部位也有所不同，菇类多以菌柄与菌盖相连处（分生能力最强）为佳。割取前，先用70%酒精擦试或用0.1%升汞溶液浸泡1－3分钟，再用无菌水冲洗数次，洗去升汞残液，用无菌纱布揩　干。然后将菇体纵向剖开，在菌柄与菌盖相接处割取绿豆大一块菌肉，移至培养基斜面上，待菌丝长出后即转管纯化。
　　（3）基内分离法　因木耳、银耳的子实体中菌丝含量极少，进行组织分离长话短说不易成功，而只能取其生长的基质即菇林、耳木等进行分离培养，这种分离母种的方法称基内分离法。
　　其方法是选生长旺盛、无病虫害的2－3年的菇木或耳木一段，充分晾干后，在子实体着生部位，垂直截取1厘米厚的一段，去皮后用75%酒精擦试消毒，然后在酒精灯上轻度灼烧或放入0.1%升汞溶液中消毒1－2分钟，再用无菌水冲洗数次洗去升残液，无菌吸水纸吸干，尔后用无菌刀片将木块四周劈除，取中间部分辟割成火柴杆粗细约0.5厘米长的小木梗，取一个放入试管通过上述诸方法所获得的纯种，培养基斜面上，25摄氏度恒温培养，待小木梗周围长出白色菌丝，及时转管纯化。
　　通过上述方法所获得的纯种，需要从中选出最优的菌株，进一步扩大繁殖，成为生产用母种。
　　3、接种　　食用菌的孢子可部分组织以及菇木小块移接到培养基上的过程就是接种。上述的母种分离过程中实际已经饮食了接种的内容。其具体操作规程是：
　　（1）准备工作　　母种分离一定要在经过消毒的接种箱或接种室内进行，接种前要检查箱或室是否严密无缝隙，以做一日和尚撞一天钟杜绝与外面未经消毒的空气相互流通。消毒前要把母种分离时所用的一切材料用具（种菇、试管、培养基、酒精灯、用塑料薄膜包好的火柴、刀片、镊子、接种针、75%酒精浸过的酒精棉等）无一遗漏地放入接种箱或室中。要注意材料用具摆放的顺序，适合操作程序，取放方便。
　　（2）消毒灭菌　　接种箱内灭菌时，可用小烧杯加10毫升甲醛，放入接种箱内，然后倒入5克高锰酸钾，将烧杯轻轻摇晃后有蒸气产生，迅速封闭接种箱，密闭消毒40分钟。若箱内无红外线灯，则在后20分钟时开启，进行甲醛与紫外线交叉消毒。
　　（3）接种　　接种前先剪短指甲，用肥皂水洗手和前臂，指尖、手指用75%酒精棉球擦拭消毒，然后将手伸进接种箱中操作。首先点燃酒精灯，然后用酒精棉球擦拭种菇表面，尤其是割取组织的部位要重点控试，将刀片在火焰上（外焰）烧一（先烧刀把，逐步移向刀把），把种菇纵剖，在菌盖与菌柄相接处切一黄豆小大的小块，然后将镊子尖在火焰上灼烧消毒，在酒精灯火焰上方把切割组织小块取下来，迅速放上种菇，拿起培养基，同样在火焰上方用小指和无名指拔下棉塞，把试管口和拔下的棉塞都略烧一烧，随即用镊子把组织小块送到试管培养基斜面上，塞好棉塞后，再离开火焰，放好后，用同样方法接种下一管。整批全部接完，再打开接种箱，将接种完毕的试管移入恒温箱中25摄氏度培养。一般3天可长出菌丝，7天可长满培养基斜面。
　　接种过程应注意：①坚持无菌操作。②注意药物的副作用。酒精渗透力强，因此种菇表面消毒时间不宜过长，以免酒精渗入种菇杀死内部组织和菌丝，导致分离失败。③操作时间不宜拖长，时间越短、动作越迅速杂菌污染的机会就越小。④注意检查杂菌。在母种培养过程中，每天都要观察菌丝生长的状况，若发现培养基上有青、绿、黑红、黄等颜色小点，说明已被杂菌感染，应及早单独分离或将该管淘汰。
　　4、母种的扩大繁殖　　母种分离的成功，仅是菌种生产的第一步，还必须把母种扩大繁殖后，才能接原种。
　　母种接种一周左右，菌丝已布满斜面，选取洁白健壮的母种试管，连同若干支斜面培养基试管、接种针等用具一齐放入接种箱中，消毒灭菌后进行转管操作，其操作过程如图4－7。
　　整批试管全部接完后，移入箱培养。注意：整个过程都必须在火焰上方进行；伸入试管的部分都需预先在火焰上消毒；手不要接触试管口，也不要接触棉塞塞入试管的部分；试管口与棉塞可略烧一烧，每个棉塞要分别塞回原来的试管，防止交叉感染；一般每支母种试管一次可扩大培养10支，但不要多次转管，否则会削弱菌丝生活力，降低出菇率。
　　（三）原种的培育　　将母种接种到玉米、麦粒、锯末、玉米芯等培养基上，培养出的菌丝称做原种，也叫二级菌种。制作原种的目的是：①扩大菌种量，满足生产需要；②改换母种菌丝营养条件，使之接近于生产条件，增加适应能力；③对菌种的生命力、纯度进行检验，以免贻误生产。
　　原种培养的设备用具以及菌种转接的规程与母种基本相同，只是培养基的配制原料、配制方法以及盛装培养基的容器农救会变更了。
　　1、原种培养基的西方与配制方法
　　（1）谷料培养基　　将谷粒或麦粒、高粱、玉米、稻子等去杂质泥沙，用水浸泡12－24小时（以吸足水分泡透为度），捞出淋水后装瓶灭菌即成。此方适用于蘑菇、平菇、凤尾茹等，也适用于菌种保藏。其优点是营养万分高，菌丝长势壮，缺点是成本造价高。
　　（2）锯末培养基　　锯末78%+米糠（或麦麸）20%＋糖（葡萄糖、蔗糖、砂糖、白糖、红糖）1%＋石膏粉1%＋水。
　　配制方法是将锯末、米糠、石膏粉按比例称重，拌合均匀，把糖用少量水溶化后，加到料中一起拌匀，继续加水搅拌揉搓，并不断测试含水量，当手用力握料指缝有水渗出并下滴1－2滴时，含水量即在60－65%，最为适宜，即可装瓶灭菌，此方法广泛适于菇类、耳类、猴头、灵芝等食用菌。
　　同时还有：玉米芯培养基、酒糟培养等。
　　配制原种培养基时还需了解以下几点：①培养基中的锯末不能用松柏木屑，这些树林有油脂，抑制菌丝生长。②南方农产品副料中的棉籽壳、花生皮等可取代各配方中的玉米芯、锯末、酒糟。③不同各类对培养基酸碱度的要求不同，可用石灰粉或其它碱类调高PH值（呈碱性），用5%稀盐佳节又重阳酸或米醋、酸菜水等调低PH值（呈酸性）。
　　选用哪种配方应根据当地原料条件，因地制宜安排生产。
　　2、原种培养基的装袋（瓶）与灭菌　　盛装原种培养基的容器主要用罐头瓶，其它广口瓶类也可以。
　　①装瓶。其程序是：装瓶→水洗→打孔→封瓶
　　装瓶：将配制好的培养基装入干净罐头瓶中，边装边用拇指向瓶四周轻轻挤压，要求装得上紧下松，周围紧中间松，翻瓶时不倒出为宜。
　　水洗：每装一瓶后立即水洗。方法是先将瓶下2/3部分在浅水里浸一下即提出，再翻瓶将上1/3部分浸水提出。目的是洗去瓶外沾粘的培养料，避免杂菌附生。
　　打孔：将水洗后的料瓶用打孔器（上粗下细的圆锥形棒，亦称锥形捣木）在瓶中央从上到下打一到底孔。其作用是提高灭菌效果；笪菌丝迅速蔓延生长。
　　封瓶：用单层牛皮纸（也可用双层报纸）封瓶口，外缚皮套。皮套可用自行车或手推车内胎剪成。
　　②灭菌。原种培养基的灭菌，要求同母种培养基灭菌一样严格。
　　3、接种　　经过灭菌的培养基，凉透后即可移入接种箱（室）中进行接种。
　　①接种前的准备工作。与母种接种大致相同。先检查接种箱的密闭情况，然后将母种菌种、原种培养瓶、封盖塑料、备用皮套及相应用具全部放入接种箱中，消毒灭菌。
　　②操作方法。先将接种针火焰，然后在火焰上方拔去母种试管棉塞，进行试管口火焰。迅速打开原种培养基瓶中接种孔内。盖上纸盖，上面加盖塑料薄膜，套上皮套即成。同样方法再接下一瓶。一管母种可接种5－8袋（瓶）原种。接种后的原种培养瓶（袋）要移入培养室或温箱中25度恒温培养。
　　封瓶时，在牛皮纸外加盖塑料薄膜的目的是防止水分蒸发。如果原种培养基采用常压灭菌法，则在装料封瓶时就可加盖塑料膜，随培养基一起灭菌，这样可以减少杂菌污染。
　　湿度高达30摄氏度以上时，可在早晨和晚上接种，以减少污染，增大成功率。
　　4培育　　原种培育的条件及注意：①培养室清洁卫生，有通风设备；②菌丝培养的最适湿度为25摄氏度。湿度低菌丝生长缓慢，湿度高菌丝生长快，但纤细、生命力弱，一般不宜超过28摄氏度；③空气相对湿度为60－70%；④避免强光与直射光，可无光培养；⑤后期要经济学通风，保持室内空气新鲜；⑥为合理利用究竟，培菌袋（瓶）可重叠摆放3－5层，上下（袋）瓶之间成品字，便于空气流通，避免内层湿度偏高；⑥经常检查。食用菌菌丝一般为奶白色，浓厚粗壮边缘较整齐，生长较慢，杂菌的颜色为红、绿、黑、黄等色，生长快，边缘不整齐。培养时要经常检查，发现杂菌感染要及时淘汰；⑧建立原种培养记录簿，记录母种的来源、型号及生长情况，以便选择优良品种当奶白色菌丝长满全袋（瓶）时，原种即成。
　　（四）栽培种的培育　　用原种扩大繁殖在培养基上的菌丝即为种，是直接用于生产栽培的菌种，也叫三级菌种或生产种。其特点是：①比原种的数量更大；②所用培养基的配方和配制方法与原种相同；③接种前的准备、灭菌、消毒及接种后的培养管理等也都与原种相同；④每袋（瓶）原种可扩接50－100袋（瓶）栽培种。
　　三、菌种的保藏
　　一个优良的菌种被选育出来以后，必须保持其优良性状不退化，不污染杂菌，不死亡，才不至降低生产性能。因此，保藏好菌种，对食用菌研究和生产都具有十分重要的意义。
　　菌种保藏的基本手段是采用干燥、低温、冷冻、减少氧气供给等方法终止其繁殖，降低其代谢强度，使之牌休眠假死状态。菌种保藏主要是母种的保藏，其方法很多，常用的简便易行的有以下几种：
　　试管封藏法。将已萌发无污染的斜面菌种，从试管口将棉塞剪平，用固体石蜡封口，外包牛皮纸塑料袋，轩冰箱中4－5摄氏度低温保藏，可保藏3－5个月。然后再转管继续保藏（但转管最多不能超过5次）。如果没有冰箱，可埋藏于固体尿素及碳酸铵中，或悬入井底，可保藏2－3个月。 此外还有液体石蜡保藏法、沙土保藏法、滤纸片保藏法等。
　　原种、栽培种在使用前，也要放在低温、通风、黑暗、干燥处保存。