食用菌液体菌种发酵罐规范化操作规程

春雨菌业

　　食用菌液体菌种由于其有利于高效率、工厂化、规范化栽培，解决了食用菌集约化生产中的瓶颈制约难题，且与固体菌种相比具有生产周期短、菌龄一致、出菇齐、成本低、纯度高、活力强等优点，越来越受到食用菌栽培者的青睐，已成为食用菌产业的发展趋势。但由于发酵罐的操作需要较强的专业知识，提高发酵成功率一直是普通生产者的使用难题。笔者经过几年对70型发酵罐的生产实践，总结出了该设备高成功率的实用规范化操作规程，供大家借鉴。
　　食用菌液体菌种生产流程：罐的清洗和检查－煮罐－配料－灭滤芯、无菌水、接种枪管－上料－灭菌(安装滤芯计时开始时开气泵吹干滤芯)－降温(先接进气管后放，并瓶)－发酵罐接种(第2天装袋灭菌)－培养一接菌袋(瓶)。
　　1 清洗与检查发酵罐在每次使用后或再次使用之前都必须进行彻底清洗，除去罐擘的菌球、菌块、料液及其它污物。对于内壁粘附的污物可以用木棒包扎软布揩拭，洗罐水从罐底接种阀排出。如有大的菌料(块)不能排出，可卸下进气管的喷嘴排出菌料(块)。清洗的标准：罐内壁无悬挂物，无残留菌球，排放的水清澈无污物。
　　罐清洗完毕即可加水，加水量以超过加热管为宜(绝对禁止加热管干烧)。然后启动设备，观察检查控制柜、加热管工作是否正常，各阀门有无渗漏，检查合格方能开始工作。
　　2 煮灌正常生产不须煮罐，上一次生产完只需将罐洗净就可进入下一批生产。如果有下列情况之一者须要煮罐：①新罐，初次使用须要煮罐；②上一次污染杂菌的罐；③更换生产品种的罐；④长时间不用的罐。
　　煮灌是对罐内进行预消毒的过程，具体操作方法：①关闭罐底部的接种阀和进气阀，把水从进料口加入至视镜中线，盖上进料口盖，拧紧，关闭排气口。②启动电源，按控制柜灭菌键4s，屏幕上两个加热指示灯亮，此时设备进入灭菌状态。③当温度达到100℃时排放冷气，微微打开排气阀直至灭菌结束。④当控制柜显示屏上的显示温度123℃、压力表压力0.12MPa时，控制柜自动计时，显示屏上交叉显示温度和计时时间。当时间达35min后，控制柜自动报警，此时按控制柜报警停止键，并关闭排气阀，闷20min后，打开排气阀、接种口、进气口，把罐内的水放掉，煮罐结束。在煮罐的同时进行煮料、灭滤芯及接种枪。
　　3 滤芯、滤芯上盖及进气管、接种枪及软管的灭菌拆下滤芯外壳灭菌，也可整体灭菌。进气管口用8～10层医用脱脂纱布包扎。接种枪及软管口用8～10层医用脱脂纱布包扎。装锅时，滤芯向下，滤芯上盖接口处的出气管无折角、盘管无折角，口向上，瓶上盖一层聚丙烯塑料膜。0.05MPa排气循环2次或打开排气阀待冒大气5～10min，0.11MPa温度121℃计时40min，保持0.11～0.15MPa，低于0.11MPa要重新计时。
　　4 上料关闭下端进气阀和接种阀(出料口)，将漏斗插入进料口，将料液由进料口倒人或用水泵抽入处理好的发酵罐中，加泡敌3瓶盖(矿泉水瓶盖)约12mL，用水冲洗煮料锅，装料量为罐体总容积的60％～80％，70型加量(45土5)L。加料高度以高于视镜上边缘10cm为宜(至标牌l一半处，最高不超过标牌1)。拧紧进料口盖，以防泄气。
　　5 培养基灭菌关闭所有阀门，启动电源，按控制柜灭菌键4s，加热I、Ⅱ的指示灯亮，此时进入灭菌状态。控制柜显示屏的显示温度100℃时排放冷气，微微打开排气阀直至灭菌结束。在加热前期(100℃前)料液很少翻腾，发酵罐底部料液因沉淀粘度增大更易于粘附于加热棒上变糊，料液中出现有少量糊块或小片。为防止产生糊料，可在培养基达到100℃前，使未过滤的空气直接通入以起到搅拌作用。
　　当控制柜显示屏上的温度123℃、压力表压力0.12MPa时，控制柜自动计时，显示屏上交叉显示温度和灭菌时间。计时开始时排料，在35min内前、中、后期(0、17、30min)排3次料，排料方法是微开进气口和接种口阅门，有少量气、料排出即可，每次排料3～5min。3次共排料3～5L，少于3L达不到目的，大于5L浪费(每升可接50袋)。排料目的，一是排出阀门处生料，二是对阀门管路进行杀菌。当灭菌计时到35min，控制柜自动报警，此时按控制柜停止报警键，培养基灭菌结束。
　　灭菌时，打扫煮料用具，安装空气过滤器(滤芯必须在使用之前30min灭好菌)，在灭菌计时打开气泵(气泵自打开后一直不可停)，此时不接进气管，使压缩机于吹30min，目的是吹于滤芯。
　　6 培养基冷却培养基冷却，是把培养基温度由123℃降至25～28℃的过程。可采用两种冷却方法：一是通冷水，利用循环冷却水进行冷却降温。二是接管通气，在培养料灭菌最后一次放料后，用火焰灼烧进气口10～20s，迅速接上进气管，但由于此时罐压还很高，不能立即通气，可通过调整贮气罐(也叫油水分离器)底阀使气压维持在0.12MPa左右，同时缓慢开大培养罐顶部的排气阀，待罐压降至0.1MPa时即可关闭贮气罐底阀，微开排气阀，“先接后放”，待贮气罐的压力高于罐压0.02MPa开阀进气，使培养基在气体的搅拌下迅速降温，并一直通气供氧直至培养结束。待高于培养温度2℃关掉冷却水，可延长加热管寿命。正常情况下，70型发酵罐冷却至培养温度约需60min。
　　7 罐内接种首先要准备好火圈(棉花缠紧，用纱布套上)、火机、95％工业酒精、手套(耐热、耐火，不可用石棉手套，和预湿手套等用品。然后开大排气阀，罐压接近0时关闭。利用火焰保护进行罐内接种，把火圈放在进料13的上方点燃。快开进料口盖(气泵不能关闭)。从火焰的中部将橡胶塞拔下，迅速倒入菌种，迅速把进料口盖过火焰烧后盖好，拧紧，熄灭火焰，移走火圈接种完毕。
　　8 培养启动设备控制柜进入培养状态，微开排气阀使罐压至0.02～0.04MPa，并检查培养温度和空气流量1.2m3/h以上，即可进入培养阶段。根据品种温型，选择培养程序，常规品种选培养I档(24～26℃)，高温品种选培养Ⅱ档(28～31℃)。设备启动后自动进入培养I程序，按键控制柜自动转换培养Ⅱ程序，在培养过程中根据菌丝的溶氧要求控制供氧量，一般来讲控制空气流量在1.2～1.5 m3/h(若低检查管路，更换垫)，对于各种食用菌菌种都较为合适。为降低气泵工作压力，可将流量计调至最大，此时罐内压力为0.02MPa，过滤系统的压力在0.04～0.06MPa。罐压低于0.02MPa易染杂菌，高于0.04MPa会降低寿命，气体气泡直径变小，溶氧减少，高压时CO2溶解度大于O2。每天放贮气罐底下水。
　　9 取样观察接种24h以后，每隔12h可从接种口取样1次，观察菌种萌发和生长情况.一般三看一闻：一看菌液颜色，正常菌液颜色纯正。虽有淡黄、橙黄、浅棕色等颜色，但不混浊，大多越来越淡(蜜环菌、鸡腿菇、木耳变深)；二看菌液澄清度，大多澄清透明(木耳、灵芝有些乱菌丝)，培养前期略显浑浊，培养后期菌液中没有细小颗粒及絮状物，因而菌液会越来越澄清透明，否则为不正常；三看菌球周围毛刺是否明显及菌球数量的增长情况，食用菌菌球都有小小毛刺，或长或短，或软或硬(白金针菇硬刺)。在48～72h菌球浓度增长较快，体积百分比浓度≥80％即可接袋。若变浑浊、霉味、酒味，颜色深说明已坏。一闻是闻菌液气味，料液的香甜味随着培养时间的延长会越来越淡，后期只有一种淡淡的菌液清香味。木耳、金针菇香味淡，白灵菇香味浓，灵芝有药味，香菇淡酒糟味。
　　注：实际接袋时间以取样为准：静置5min，菌球既不漂浮，也不沉淀，菌液澄清透明，菌球、菌液界限明显，袋内温度降至30℃以下(第l天接液体罐，第2天装袋)。若无菌袋，关闭启动电源，冷水降至15℃下，可保持2d。
　　10 接菌包液体菌种培养好后，在火焰的保护下接好接种管，不停泵，关小排气阀，待压力稳定在0.03～0.05 MPa时接种。
　　11 注意事项①滤芯，耐蒸汽杀菌130℃200h。当不用时，应拆下用报纸包上放在阴凉干燥处保存。使用时禁止料液倒流损坏滤芯，如发现发酵罐倒流现象时，应把滤芯用热水浸泡(不能刮、不能刷洗)，打开压缩机通气流将各孑L的料液吹出，阴凉处凉干。②培养过程中突然停电，应立即关闭排气阀和进气阀，并用打气筒在贮气罐的进气口打气(进气罐内的气体必须经过过滤器的过滤)，待贾l：气罐的压力达到0.10MPa时，打开进气阀进气，可听到“咕噜、咕噜”的进气声。当气体进罐的声音渐弱时，关闭进气阀，再次打气。如此反复操作，直到罐压升至0.05～0.10MPa时保压即可，待来电正常供气培养。也可用氧气瓶代替打气筒持续向罐内供气培养，直至来电再进入正常培养状态。
　　　　
　　食用菌液体菌种发酵罐规范化操作规程
　　王丽娥1 赵文娟1 秦涛2 马齐1 吴江洪2 刘永宝3
　　(1陕西省科学院酶工程研究所，陕西西安710600；2陕西省酶工程技术中心，陕西西安7106001；3辽宁朝阳市食用菌研究所，辽宁朝阳122000)
　　食用菌2009.5