姬菇液体菌种培养基及其培养条件的优化
黄爱荣1,刘欢2,缪礼鸿1(1武汉工业学院生物与制药工程系,湖北武汉430023;1湖北轻工职业技术学院啤酒工程系,湖北武汉430070)化学与生物工程 姬菇,别名小平菇,营养丰富,具有较好的抗肿瘤保健功效。长期食用姬菇可降低人体胆固醇、血脂并增强免疫力,随着人民生活水平的提高,姬菇的市场需求量越来越大,新型液体菌种能够大大缩短姬菇栽培时间,作者在此探讨了适合姬菇液体菌种生长的摇瓶培养基和培养条件,拟为实现姬菇液体菌种固体栽培生产模式的推广应用提供科学依据。1 实验
1.1 材料
1.1.1 菌种
姬菇(Pleurot us corucopi ae),华中农业大学食用菌研究中心。
1.1.2 培养基
母种培养基:马铃薯固体培养基。
固体培养基:棉子壳88%,麸皮10%,石膏1%,石灰1%,含水量60%左右。
液体培养基:甘露醇3%,酵母粉1.0%,磷酸二氢钾0.2%,硫酸镁0.05%,VB1 10mg·(1000mL)-1。
1.2 方法
1.2.1 碳、氮源筛选实验
碳、氮源的筛选参照文献进行。
1.2.2 正交实验
分别选用筛选得到的较优碳、氮源,以磷酸二氢钾、硫酸镁为无机盐,pH值自然,进行正交实验,以获得最佳的培养基。
将干燥的玉米粉过40目筛,添加到培养基中,测定菌丝球生物量,考察玉米粉添加量和发酵条件(如初始pH值、温度、装液量、通气量等)对菌丝球产量的影响。按DNS比色法确定发酵终点。
1.2.3 液体菌种与固体菌种在栽培料上生长速度的比较实验
按5%接种量在栽培料上分别接固体菌种和液体菌种各10瓶,置于恒温培养室中培养,观察菌丝萌发生长情况。
2 结果与讨论
2.1 碳、氮源筛选实验(图1,图2)
http://www.jssyj.com/UpFiles/BeyondPicTP/201103/2011318205734399.jpg图1 最佳碳源的选择http://www.jssyj.com/UpFiles/BeyondPicTP/201103/2011318205810646.jpg图2 最佳氮源的选择 从图1、图2可知,姬菇生长最优的碳源是甘露醇,其余依次是果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉;姬菇生长最优的氮源是酵母粉,其次是蛋白胨、氯化铵、玉米粉、硫酸铵、尿素。这表明姬菇可能偏向于较为复杂的有机营养物质作为自身生长合适的碳、氮源。
2.2 培养基优化正交实验(表1,表2)
表1正交实验因素和水平/%http://www.jssyj.com/UpFiles/BeyondPicTP/201103/2011318205842730.jpg表2 正交实验结果与分析http://www.jssyj.com/UpFiles/BeyondPicTP/201103/2011318205933212.jpg 从表2可知,A因素(甘露醇)的影响最大,C因素(磷酸二氢钾)的影响最小。最优培养基为A3 D1 B2 C2 ,即甘露醇3%、酵母粉1.0%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.05%。镁离子、钾离子、磷酸盐是生物合成的必需物质,甘露醇与酵母粉提供的碳氮比基本与姬菇栽培生长的最适碳氮比相同。
2.3 玉米粉添加量对菌丝球产量的影响(表3)
表3玉米粉添加量对菌丝球产量的影响http://www.jssyj.com/UpFiles/BeyondPicTP/201103/20113182104629.jpg 玉米粉作为一种天然的有机氮源,不仅能给菌丝生长提供氮元素,而且提供了一定的粘度,即提供了液体培养过程中的剪切力,以不断切断形成的菌丝产生新的菌丝球萌发点,使得菌丝球的直径保持在1mm而不至于过大,从而促使菌丝球在液体中均匀一致。
从表3可知,玉米粉的添加量为0.5%时,菌丝球较少、直径较大,1.0%、1.5%、2.0%添加量时菌丝球大小均一、数量较多,故在相同产量情况下按经济原则,选择1.0%添加量为宜。
2.4 培养条件对菌丝球产量的影响(表4)
表4培养条件对菌丝球产量的影响http://www.jssyj.com/UpFiles/BeyondPicTP/201103/201131821033361.jpg 从表4可知,姬菇菌丝在各个不同初始pH值均能生长,以中偏酸性为佳,pH值为6和7之间差异较小,但是在长时间培养时酸性条件可以大幅降低真菌等杂菌污染的几率,因而选择最佳pH值为6。
姬菇菌丝在20～28℃都能正常生长,其中以24℃、26℃时菌丝生长最活跃,菌丝生长速度、菌丝球质量均较好;作为液体菌种,菌丝球数量越多且直径越小,单位体积中萌发点越多,越适合于实际生产,26℃相对而言效果更好。
在不能对三角瓶通入无菌空气的情况下,装液量是影响溶氧浓度的一个关键因素。装液量过大,液面接触的空气面积小,单位体积的液体溶氧量就小,从表4可知,250mL的三角瓶中,装液量以90mL为宜。
在摇床转速为150r·min-1时菌丝球的质量与数量均处于较佳的状态。菌丝在液体中生长需要消耗氧气,随着摇床转速的提高,液面接触空气的面积增大,利于溶氧水平的提高,同时剪切力增加,菌丝不断地被切断,形成新的菌丝球萌发点,从而生长出新的菌丝球。
2.5 液体菌种发酵终点的确定
http://www.jssyj.com/UpFiles/BeyondPicTP/201103/201131821115583.jpg图3 发酵液中还原糖含量变化 从图3可知,在接种后第4～5d,发酵液中还原糖含量达到最高点,然后开始下降,其中生物生长处于高峰期向稳定期过渡,而发酵至第6d时,还原糖含量处在一个稳定的最低点时,发酵液中菌丝生长量到达最顶点,而到达第7d生物量并无明显变化,且培养时间越长,污染几率越大,因此确定发酵终点在第6d。
2.6 液体菌种与固体菌种在栽培料上生长速度的比较
用姬菇液体种子接种栽培瓶时,平均16d左右菌丝生长满瓶;固体种子接种栽培瓶时,平均需28d左右满瓶,对于同样的接种量,液体菌种较固体菌种的生长速度高出75%,且液体菌种中菌丝球分布均匀,菌丝球以及菌丝片段多,在接触的固体料上多点同时萌发生长,菌丝球接种时都处于生长活跃期,生长能力相对旺盛,适应时间短,接种后迅速生长。此外液体菌种接种方便,接种量易于控制,菌种菌龄一致,污染小,适合工业化大规模流水线生产,能够大大提高生产效率。
3 结论
通过单因素实验和正交实验确定了姬菇液体菌种的最佳培养基为:甘露醇3%、酵母粉1.0%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.05%、玉米粉1.0%。最佳的发酵条件为:培养基初始pH值6、培养温度26℃、培养时间6d、装液量90mL·(250mL)-1、摇床转速150r·min-1,液体菌种生长明显快于传统的固体菌种。姬菇液体菌种方便、快捷、一致性高、可控性强,更适合大规模工业化生产,但对姬菇菌种的生物学活性以及液体菌种生产姬菇的稳定性、安全性还需要做更深入的研究,生产过程中菌种的改良优化仍有相当大的发展空间。
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作者简介:黄爱荣(1982- ),男,江苏泰州人,硕士研究生,研究方向:生物工程;通讯联系人:缪礼鸿,男,副教授。
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